NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHẬN DIỆN SỚM SỰ CỐ KỸ THUẬT (Phần II)

Tiếp nối phần I, sau khi nhận diện các dấu hiệu bất thường thường gặp trong quá trình nuôi cấy tế bào như tăng trưởng chậm, bong khỏi bề mặt nuôi cấy hoặc môi trường đổi màu nhanh, phần II sẽ tập trung vào các vấn đề có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phục hồi và độ ổn định của dòng tế bào.
Với định hướng đồng hành cùng hoạt động nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực thú y, Fivevet tiếp tục phân tích các sự cố như giảm tỷ lệ sống sau rã đông, nhiễm tạp hoặc tế bào không bám dính. Nếu không được phát hiện và xử lý đúng cách, những vấn đề này có thể làm giảm chất lượng mẫu, sai lệch kết quả thí nghiệm và tăng nguy cơ mất dòng tế bào có giá trị nghiên cứu.
Vì vậy, việc hiểu rõ nguyên nhân, áp dụng biện pháp khắc phục phù hợp và chuẩn hóa quy trình thao tác là yếu tố quan trọng giúp phòng thí nghiệm duy trì hiệu quả nuôi cấy ổn định trong thời gian dài.

Tỷ lệ tế bào sống thấp sau rã đông là hiện tượng số lượng tế bào còn sống giảm đáng kể sau khi chuyển từ trạng thái đông lạnh về điều kiện nuôi cấy bình thường. Biểu hiện thường gặp là nhiều tế bào chết trong 24 giờ đầu, tế bào bám dính kém ( đối với tế bào bám dính) và tăng trưởng chậm trong giai đoạn phục hồi.
Nguyên nhân chủ yếu liên quan đến tổn thương hóa học và cơ học xảy ra trong quá trình đông – rã không được kiểm soát tối ưu. 

- Rã đông quá chậm: Khi quá trình rã đông diễn ra chậm, tế bào phải tiếp xúc kéo dài với dimethyl sulfoxide (DMSO – chất bảo vệ tế bào khi đông lạnh nhưng có độc tính ở nhiệt độ thường). Thời gian tiếp xúc càng lâu càng làm tăng tổn thương màng tế bào, dẫn đến giảm tỷ lệ sống và khả năng phục hồi.
- Đông lạnh không đúng tốc độ: Nếu tốc độ làm lạnh không đạt khoảng -1oC/phút, nước trong tế bào có thể hình thành tinh thể đá nội bào. Các tinh thể này làm phá vỡ màng tế bào và cấu trúc bên trong, gây tổn thương không hồi phục và làm giảm khả năng sống sau rã đông.
- Bảo quản không ổn định hoặc lưu trữ quá lâu: Dao động nhiệt độ trong bình nitơ lỏng hoặc thời gian lưu trữ kéo dài có thể làm giảm chất lượng tế bào theo thời gian. Điều này khiến tế bào yếu dần và giảm khả năng thích nghi khi quay lại môi trường nuôi cấy.
- Ly tâm quá mạnh sau rã đông: Lực ly tâm cao trong bước xử lý sau rã đông có thể gây tổn thương cơ học cho tế bào vốn đang ở trạng thái yếu, làm tăng tỷ lệ tế bào chết và giảm khả năng bám dính hoặc phục hồi.

- Rã đông nhanh ở 37°C trong 1-2 phút. Rã đông nhanh giúp giảm thời gian tế bào tiếp xúc với DMSO ở nhiệt độ có độc tính, từ đó hạn chế tổn thương màng tế bào và cải thiện tỷ lệ sống.
- Loại bỏ DMSO sớm sau rã đông, nhanh chóng pha loãng và loại bỏ DMSO bằng môi trường nuôi cấy hoặc bước rửa tế bào, giúp giảm độc tính kéo dài lên tế bào.
- Sử dụng hệ thống đông lạnh kiểm soát tốc độ (controlled-rate freezing - thiết bị đông lạnh có kiểm soát tốc độ) giúp đảm bảo tốc độ giảm nhiệt ổn định khoảng −1°C/phút, hạn chế hình thành tinh thể đá nội bào và bảo vệ cấu trúc tế bào trong quá trình đông lạnh.
- Tối ưu lực ly tâm theo từng dòng tế bào. Điều chỉnh tốc độ và thời gian ly tâm phù hợp với từng loại tế bào để tránh gây stress cơ học không cần thiết, đặc biệt với các dòng tế bào nhạy cảm.

Nhiễm tạp là sự cố nghiêm trọng trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt là nhiễm nấm, vi khuẩn hoặc Mycoplasma. Khi tế bào bị nhiễm nấm, môi trường thường đục, pH thay đổi nhanh, màu môi trường biến đổi bất thường, xuất hiện hạt lơ lửng hoặc mùi lạ. Dưới kính hiển vi có thể quan sát thấy các cấu trúc dạng sợi đặc trưng của nấm.
Tình trạng này không chỉ làm giảm chất lượng tế bào mà còn làm tăng nguy cơ lây nhiễm sang các mẫu nuôi cấy khác trong phòng thí nghiệm.

- Thao tác vô trùng không đúng cách: Quy trình thao tác vô trùng không được thực hiện đúng cách là nguyên nhân phổ biến dẫn đến nhiễm nấm. Việc mở nắp bình nuôi cấy quá lâu, thao tác ngoài vùng vô trùng hoặc làm gián đoạn luồng khí sạch trong tủ an toàn sinh học đều có thể tạo điều kiện cho vi sinh vật xâm nhập vào môi trường nuôi cấy.
- Pipette hoặc hóa chất bị nhiễm: Các vật tư và hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào như pipette, môi trường nuôi cấy hoặc dung dịch thí nghiệm nếu không được bảo quản đúng cách hoặc đã nhiễm vi sinh vật trước đó có thể trở thành nguồn lây nhiễm trực tiếp cho tế bào.
- Tủ cấy không được khử khuẩn đúng cách: Tủ an toàn sinh học nếu không được vệ sinh và khử khuẩn định kỳ sẽ tạo điều kiện cho bào tử nấm tích tụ trên bề mặt làm việc hoặc trong luồng khí, từ đó làm tăng nguy cơ nhiễm vi sinh trong quá trình thao tác.
- Nước trong tủ ấm CO₂ bị nhiễm: Nước sử dụng trong tủ ấm CO₂ có thể trở thành môi trường thuận lợi cho nấm và vi khuẩn phát triển nếu không được thay thường xuyên hoặc không bổ sung chất khử khuẩn phù hợp. Đây là nguồn nhiễm vi sinh khá phổ biến nhưng thường bị bỏ sót trong phòng thí nghiệm.

- Trường hợp nhiễm nhẹ, một số phòng thí nghiệm có thể sử dụng tạm thời chất kháng nấm như amphotericin B, tuy nhiên đây không phải giải pháp lâu dài vì có thể ảnh hưởng đến tế bào và che giấu nguồn nhiễm.
- Trường hợp nhiễm nặng, nghiêm trọng: Nên loại bỏ hoàn toàn để tránh lây nhiễm sang các dòng tế bào khác trong phòng thí nghiệm.
Phòng ngừa:
- Khử khuẩn tủ an toàn sinh học định kỳ: Vệ sinh và khử khuẩn tủ cấy thường xuyên giúp giảm nguy cơ tích tụ vi sinh vật và duy trì môi trường thao tác vô trùng ổn định.
- Sử dụng đầu côn có màng lọc: Đầu côn có màng lọc giúp hạn chế sự phát tán của các giọt khí dung chứa vi sinh vật và giảm nguy cơ lây nhiễm chéo giữa các mẫu trong quá trình thao tác.
- Thay nước trong tủ ấm thường xuyên: Việc thay nước định kỳ và vệ sinh tủ ấm giúp hạn chế sự phát triển của nấm và vi khuẩn trong môi trường ẩm.
- Hạn chế sử dụng kháng sinh kéo dài: Lạm dụng kháng sinh trong nuôi cấy tế bào có thể che giấu tình trạng nhiễm vi sinh ở giai đoạn đầu, khiến việc phát hiện nhiễm tạp trở nên khó khăn hơn và làm tăng nguy cơ nhiễm kéo dài.

Tế bào không bám dính sau khi gieo cấy là tình trạng thường gặp ở các dòng tế bào bám dính và có thể ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tăng trưởng cũng như kết quả thí nghiệm. Sau nhiều giờ gieo vào bình nuôi cấy, tế bào vẫn lơ lửng trong môi trường, không trải rộng hình dạng đặc trưng mà co tròn hoặc kết tụ thành cụm.
Hiện tượng này thường liên quan đến bề mặt nuôi cấy không phù hợp, tổn thương tế bào trong quá trình xử lý hoặc môi trường nuôi cấy chưa đáp ứng đầy đủ điều kiện cần thiết cho quá trình bám dính. 

- Sử dụng sai loại bề mặt nuôi cấy: Một số dòng tế bào chỉ có thể bám dính tốt trên bề mặt đã được xử lý chuyên biệt cho nuôi cấy tế bào. Nếu sử dụng dụng cụ không đạt chuẩn, tế bào có thể khó bám hoặc bám rất kém. Ngoài ra, một số loại tế bào nhạy cảm còn cần phủ thêm các thành phần nền ngoại bào như collagen hoặc Matrigel để hỗ trợ quá trình bám dính và phát triển.
- Tế bào bị tổn thương trong quá trình xử lý: Quá trình tách tế bào bằng trypsin hoặc thao tác hút nhả quá mạnh bằng pipette có thể làm tổn thương các protein bám dính trên bề mặt tế bào. Khi các protein này bị phá hủy, tế bào sẽ giảm khả năng bám lên bề mặt nuôi cấy và khó phục hồi sau gieo cấy.
- Môi trường nuôi cấy thiếu ion hoặc yếu tố tăng trưởng cần thiết: Các ion như canxi (Ca²⁺) và magie (Mg²⁺) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bám dính giữa tế bào với bề mặt nuôi cấy. Nếu môi trường thiếu các thành phần này hoặc không bổ sung đầy đủ yếu tố tăng trưởng cần thiết, khả năng bám dính và tăng sinh của tế bào có thể bị ảnh hưởng đáng kể.
- Dòng tế bào đã lão hóa: Số lần cấy chuyển quá cao có thể khiến tế bào dần mất ổn định về đặc tính sinh học. Khi tế bào bị lão hóa, khả năng bám dính, tăng trưởng và phục hồi sau gieo cấy thường giảm rõ rệt.

- Sử dụng dụng cụ nuôi cấy đạt chuẩn: Nên sử dụng bình hoặc đĩa nuôi cấy chuyên dụng dành cho nuôi cấy tế bào để đảm bảo bề mặt phù hợp cho quá trình bám dính.
- Phủ bề mặt bằng collagen hoặc Matrigel khi cần: Đối với các dòng tế bào khó bám hoặc tế bào nguyên phát, việc phủ thêm lớp nền ngoại bào như collagen hoặc Matrigel có thể giúp cải thiện đáng kể khả năng bám dính và tăng trưởng.
- Kiểm soát số lần cấy chuyển: Theo dõi và giới hạn số passage của tế bào giúp duy trì đặc tính sinh học ổn định và hạn chế tình trạng lão hóa tế bào.
- Tối ưu môi trường nuôi cấy: Đảm bảo môi trường nuôi cấy chứa đầy đủ ion cần thiết, huyết thanh và các yếu tố tăng trưởng phù hợp với từng dòng tế bào để hỗ trợ quá trình bám dính và phục hồi hiệu quả.

Xử lý sự cố trong nuôi cấy tế bào là kỹ năng quan trọng giúp duy trì sự ổn định của thí nghiệm và đảm bảo độ tin cậy của dữ liệu nghiên cứu. Phần lớn các vấn đề như tế bào tăng trưởng chậm, bong khỏi bề mặt, nhiễm tạp hoặc giảm tỷ lệ sống sau rã đông đều có thể được hạn chế nếu phòng thí nghiệm xây dựng quy trình nuôi cấy phù hợp.
Việc kiểm soát tốt điều kiện môi trường, thao tác vô trùng, chất lượng tế bào và quy trình thao tác chuẩn cho từng dòng tế bào sẽ giúp giảm nguy cơ phát sinh sự cố. Đồng thời, đào tạo kỹ năng thao tác cho nhân sự cũng đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sai sót, giảm chi phí do phải lặp lại thí nghiệm và tránh nguy cơ mất các dòng tế bào có giá trị nghiên cứu cao.
Một quy trình nuôi cấy được chuẩn hóa không chỉ giúp cải thiện hiệu quả thí nghiệm mà còn góp phần nâng cao tính chính xác và khả năng tái lập của kết quả nghiên cứu trong thời gian dài.
Với định hướng đồng hành cùng hoạt động nghiên cứu, Fivevet luôn chú trọng xây dựng các quy trình kỹ thuật có tính chuẩn hóa, ổn định và phù hợp với thực tiễn phòng thí nghiệm. Việc kiểm soát tốt quy trình nuôi cấy tế bào không chỉ hỗ trợ nâng cao chất lượng thí nghiệm mà còn góp phần củng cố năng lực nghiên cứu, phát triển và đánh giá các giải pháp phục vụ sức khỏe vật nuôi.

Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển Vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet) 

Câu hỏi thường gặp:
1. Vì sao tỷ lệ tế bào sống giảm sau khi rã đông?
Tỷ lệ tế bào sống có thể giảm do rã đông quá chậm, tế bào tiếp xúc lâu với DMSO, tốc độ đông lạnh không phù hợp, bảo quản không ổn định hoặc ly tâm quá mạnh sau rã đông. Những yếu tố này có thể gây tổn thương màng tế bào, làm giảm khả năng phục hồi và tăng trưởng sau khi nuôi cấy lại.
2. Nên rã đông tế bào như thế nào để hạn chế tế bào chết?
Nên rã đông nhanh ở 37°C trong khoảng 1–2 phút, sau đó nhanh chóng pha loãng và loại bỏ DMSO bằng môi trường nuôi cấy hoặc bước rửa tế bào. Đồng thời, cần tối ưu lực ly tâm theo từng dòng tế bào để hạn chế stress cơ học sau rã đông.
3. Làm thế nào để nhận biết tế bào bị nhiễm tạp?
Tế bào bị nhiễm tạp thường có biểu hiện môi trường nuôi cấy bị đục, đổi màu nhanh, xuất hiện hạt lơ lửng, có mùi lạ hoặc tế bào thay đổi hình thái bất thường. Khi quan sát dưới kính hiển vi, có thể thấy cấu trúc dạng sợi của nấm hoặc các dấu hiệu vi sinh vật phát triển trong môi trường.
4. Khi tế bào bị nhiễm tạp có nên tiếp tục nuôi cấy không?
Nếu nhiễm nhẹ, một số phòng thí nghiệm có thể sử dụng tạm thời chất kháng nấm như amphotericin B, tuy nhiên đây không phải giải pháp lâu dài. Với trường hợp nhiễm nặng, nên loại bỏ mẫu nuôi cấy để tránh lây nhiễm sang các dòng tế bào khác trong phòng thí nghiệm.
5. Vì sao tế bào không bám dính sau khi gieo cấy?
Tế bào không bám dính có thể do sử dụng sai loại bề mặt nuôi cấy, thiếu lớp phủ như collagen hoặc Matrigel, tế bào bị tổn thương trong quá trình xử lý bằng trypsin, thao tác pipette quá mạnh, môi trường thiếu ion cần thiết hoặc dòng tế bào đã qua quá nhiều lần cấy chuyển.
Tài liệu tham khảo:
1. Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 8th Edition. Wiley-Blackwell, 2021.
2. Masters JR. Animal Cell Culture: Practical Approach. Oxford University Press.
3. Geraghty RJ et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 2014.
4. ATCC Cell Culture Basics Handbook.
5. Thermo Fisher Scientific. Gibco Cell Culture Protocol Guide.
6. Lonza Bioscience – Cell Culture Troubleshooting Guide.
7. Uphoff CC, Drexler HG. Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology.
8. FDA Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines.
Xem thêm:
- NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHẬN DIỆN SỚM SỰ CỐ KỸ THUẬT (Phần I)
- TỐI ƯU QUY TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHỮNG LƯU Ý QUAN TRỌNG ĐỂ ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG VÀ AN TOÀN SINH HỌC
- ĐỊNH DANH CHỦNG LOẠI VI-RÚT BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN TRONG THÚ Y