THIẾT LẬP PHẢN ỨNG TRUNG HÒA ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM DA NỔI CỤC TRÊN TRÂU BÒ

Bệnh viêm da nổi cục (VDNC) ở trâu, bò là một thách thức lớn đối với ngành chăn nuôi, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Để kiểm soát dịch hiệu quả, việc xác định chính xác tình trạng miễn dịch của đàn gia súc là rất cần thiết. Phản ứng trung hòa vi rút LSD là phương pháp xét nghiệm “tiêu chuẩn vàng” giúp phát hiện và định lượng kháng thể kháng vi rút gây bệnh này. Trong bài viết này, Fivevet xin trình bày chi tiết quy trình kỹ thuật, cách đánh giá kết quả và ứng dụng thực tiễn trong giám sát dịch tễ học và kiểm tra hiệu quả tiêm phòng.

I. Tổng quan về bệnh viêm da nổi cục

1.1. Tác nhân gây bệnh
Bệnh viêm da nổi cục (VDNC) còn được gọi là bệnh da sần, là bệnh truyền nhiễm do vi rút Lumpy Skin Disease (LSDV) thuộc họ Poxviridae, chi Capripoxvirus gây ra trên trâu, bò. LSDV thuộc cùng chi với vi rút gây bệnh đậu trên dê, cừu và có liên quan chặt chẽ về mặt kháng nguyên nhưng chúng không thể được phân biệt bằng các xét nghiệm huyết thanh học thông thường.
1.2. Đặc điểm dịch tễ
Trong bệnh VDNC vi rút chủ yếu được truyền qua trung gian là côn trùng hút máu, chẳng hạn như một số loài ruồi và muỗi hoặc bọ ve và phạm vi vật chủ hiện chỉ giới hạn ở các loại động vật nhai lại như trâu, bò. Bệnh thường xảy ra theo mùa, chủ yếu vào những tháng có thời tiết ấm, khi côn trùng hoạt động mạnh và phong phú nhất, gây tổn thất về kinh tế do hạn chế vận chuyển và thương mại.
Tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong rất khác nhau tùy thuộc vào giống gia súc, tình trạng miễn dịch của quần thể, côn trùng trung gian truyền bệnh cơ học và bản chất độc lực của các phân lập vi rút. Tỷ lệ mắc bệnh VDNC rất khác nhau, dao động từ 3% đến 85% trong các tình huống dịch tễ khác nhau. Tỷ lệ mắc bệnh ước tính là 10% ở các vùng lưu hành bệnh. Tỷ lệ tử vong liên quan đến LSDV dao động từ 1% đến 3%.
1.3. Triệu chứng
Bệnh gây thiệt hại về năng suất do sản lượng sữa giảm mạnh, giảm khả năng sinh sản, sảy thai, tổn thương da, giảm tăng trọng, gia súc có thể chết.
1.4. Phòng và kiểm soát bệnh
Tiêm chủng, kiểm dịch, kiểm soát vận chuyển gia súc, kiểm soát véc-tơ, tiêu hủy động vật nhiễm bệnh và phơi nhiễm, vệ sinh và khử trùng cơ sở đều được sử dụng để kiểm soát và ngăn ngừa LSDV. Trong chi, Capripoxvirus có phản ứng chéo. Do đó, gia súc có thể được bảo vệ chống lại LSDV bằng cách sử dụng các chủng có nguồn gốc từ Capripoxvirus từ cừu hoặc dê.
1.5. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
Theo khuyến nghị của Tổ chức Thú y thế giới (OIE), việc phát hiện kháng thể chống lại LSDV có thể được thực hiện bằng xét nghiệm trung hòa vi rút, xét nghiệm khuếch tán miễn dịch trên gel agar, xét nghiệm huỳnh quang gián tiếp, ELISA, cũng như bằng phương pháp Western blot.
Tuy nhiên, xét nghiệm trung hòa vi rút là “tiêu chuẩn vàng” và được coi là phương pháp đặc hiệu nhất để phát hiện kháng thể chống lại LSDV, xác định tình trạng lâm sàng của động vật bị nhiễm bệnh, tỷ lệ lưu hành LSD và tình trạng miễn dịch của gia súc đã được tiêm phòng trong đàn.

II. Ứng dụng của phương pháp trung hòa vi rút LSD trên tế bào
2.1. Với những trại chưa tiêm phòng vắc xin
Kết quả kháng thể Dương tính ở gia súc chưa tiêm phòng vắc xin, đồng thời gia súc có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh VDNC được xác định là gia súc đang bị mắc bệnh VDNC. Vì vậy, việc định kỳ kiểm tra kháng thể VDNC có ý nghĩa dịch tễ học để biết được sự lưu hành của vi rút.
2.2. Với những trại đã tiêm phòng vắc xin
Phương pháp VNT được sử dụng như là công cụ giám sát và đánh hiệu quả tiêm phòng vắc xin định lượng kháng thể có đạt mức bảo hộ (chỉ số GMT, PD50, tỷ lệ bảo hộ,…), độ đồng đều của kháng thể trong toàn đàn đàn (chỉ số CV và SE).
Phương pháp VNT cũng được sử dụng đánh giá mức độ bảo hộ với chủng vi rút lưu hành tại thực địa. Trong trường hợp tiêm phòng vắc xin VDNC nhưng dịch VDNC vẫn nổ ra gây thiệt hại tại các trại. Điều này có thể do biến chủng vi rút VDNC. Tại Fivevet chúng tôi tiến hành phân lập thu thập chủng VDNC trên thực địa. Những chủng vi rút phân lập này được sử dụng để đánh giá mức độ bảo hộ khi sử dụng vắc xin VDNC với chủng lưu hành tại thực địa. Từ đó, đánh giá tỷ lệ bảo hộ thực tế của vắc xin và có chiến lược lựa chọn vắc xin phù hợp.

III. Thiết lập phản ứng trung hòa vi rút LSD trên tế bào
3.1. Các bước thực hiện
a. Xử lý mẫu xét nghiệm
Mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể: Máu được lấy vô trùng, lượng tối thiểu là 1 ml, để đông, chắt lấy huyết thanh. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C. Mẫu máu sau đông li tâm lạnh ở 4000 vòng trong 10 phút thu huyết thanh. Huyết thanh bò sau khi được xử lý bất hoạt ở 56°C trong 30 phút, xử lý kháng sinh trong 60 phút.
b. Quy trình xét nghiệm trung hòa vi rút LSD trên tế bào
- Chuẩn bị huyễn dịch tế bào: Tế bào MDBK khi bám đáy 1 lớp được trypsin tách tế bào thành huyễn dịch dạng huyền phù mật độ 2x10⁵ tế bào/ml.
- Thực hiện phản ứng trung hòa vi rút: Huyết thanh được pha loãng cơ số 2 (1/2 đến 1/256) trong môi trường DMEM 1X. 50µl huyết thanh được pha loãng được ủ với 50 µl vi rút LSD chứa 200 TCID50. Ủ huyết thanh với vi rút trong 1 giờ tại 37⁰C. Sau đó thêm 100 µl tế bào MDBK mật độ 2x10⁵ tế bào/ml. Nuôi 37⁰C 5% CO₂ trong 7 ngày. Sau đó tế bào được cố định bằng formaline và nhuộm tím Violet đọc kết quả.
3.2. Đánh giá và phân tích kết quả
a. Đọc kết quả
- Giếng dương tính: (Có kháng thể) tế bào bắt màu tím đều của thuốc nhuộm.
- Giếng âm tính: (Không có kháng thể) tế bào tạo thành đám co cụm bắt màu tím của thuốc nhuộm.
- Hiệu giá kháng thể là nồng độ pha loãng cuối cùng đọc là dương tính bào bắt màu thuốc nhuộm. Hiệu giá được tính theo 2ⁿ (n là hệ số pha loãng huyết thanh).
b. Phân tích kết quả huyết thanh học
Phân tích kết quả dựa vào GMT, chỉ số bảo hộ PD50, tỉ lệ bảo hộ, Chỉ số độ biến thiên CV%, Chỉ số độ sai lệch chuẩn kháng thể SE.

IV. Xác nhận giá trị sử dụng của phản ứng VNT xác định kháng thể kháng vi rút LSD
4.1. Các thông số đánh giá
Các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp: 
- Độ chính xác: Bao gồm: 
+ Độ đúng: Mức độ phù hợp giữa kết quả xét nghiệm và giá trị thực.
+ Độ chụm: Mức độ lặp lại của kết quả trong cùng điều kiện.
- Độ nhạy: Khả năng phát hiện đúng mẫu dương tính.
- Độ đặc hiệu: Khả năng phân biệt đúng mẫu âm tính.
4.2. Mẫu chuẩn dùng xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trung hòa
- Mẫu dương tính: 20 mẫu huyết thanh bò dương tính kháng thể kháng vi rút LSD bằng phương pháp ELISA.
- Mẫu âm tính: 20 mẫu huyết thanh bò lấy từ bò không tiêm vắc xin LSD, âm tính kháng thể kháng vi rút LSD bằng phương pháp ELISA.
a. Độ chụm
- Mẫu sử dụng: 01 huyết thanh dương, 01 huyết thanh âm.
- Lặp lại thí nghiệm 10 lần.
- Xác định độ chụm theo công thức PCA Precision Categorical Agreement:
PCA(%) = X/N x100
Trong đó:
+ X là số lần có kết quả không sai lệch ±1 log2.
+ N là tổng số kết quả thí nghiệm.
- Tiêu chuẩn: PCA(%) ≥ 95%.

b. Độ đúng

- Mẫu sử dụng: 20 huyết thanh dương, 20 huyết thanh âm.
- Xác định độ đúng theo công thức CA Categorical Agreement:
CA(%) = Y/N x100
Trong đó:
+ X là số kết quả không sai lệch ±1 log2.
+ N là tổng số kết quả thí nghiệm.
- Tiêu chuẩn: CA(%) ≥ 90%.

c. Độ nhạy và độ đặc hiệu

- Mẫu sử dụng: 20 huyết thanh dương, 20 huyết thanh âm.
- Xác định độ nhạy SE Sensitivy, độ đặc hiệu SP Specificity:
SE(%) = a/(a+c) x100
SP(%) = d/(d+b)x100
- Tiêu chuẩn: SE(%) ≥ 90%, SP(%) ≥ 90%.

Phản ứng trung hòa vi rút LSD là phương pháp xét nghiệm đặc hiệu, giúp đánh giá hiệu quả tiêm phòng, phát hiện sớm nguy cơ dịch và kiểm soát miễn dịch đàn gia súc một cách chính xác. Việc áp dụng xét nghiệm này định kỳ đặc biệt quan trọng tại các vùng có nguy cơ cao mắc bệnh hoặc trại giống cần giám sát miễn dịch chặt chẽ. Nếu bạn cần hỗ trợ thực hiện xét nghiệm LSD, hãy liên hệ FiveLab để được tư vấn kỹ thuật và triển khai quy trình xét nghiệm phù hợp với điều kiện cụ thể của trại.

Câu hỏi thường gặp
1. Phản ứng trung hòa vi rút LSD là gì?
Phản ứng trung hòa vi rút LSD là kỹ thuật xét nghiệm đặc hiệu nhằm phát hiện và định lượng kháng thể kháng lại vi rút gây bệnh viêm da nổi cục (VDNC) trên trâu, bò. Đây được xem là phương pháp “tiêu chuẩn vàng” trong đánh giá miễn dịch.
2. Phản ứng trung hòa LSD được thực hiện như thế nào?
Quy trình gồm các bước: xử lý mẫu huyết thanh, chuẩn bị tế bào MDBK, pha loãng mẫu, ủ với vi rút LSD chứa 200 TCID50, sau đó ủ cùng tế bào và phân tích kết quả bằng nhuộm tím Violet sau 7 ngày nuôi cấy.
3. Các chỉ số nào được dùng để phân tích kết quả xét nghiệm?
Các chỉ số đánh giá gồm: hiệu giá kháng thể (GMT), chỉ số bảo hộ (PD50), độ biến thiên (CV%), độ sai lệch chuẩn (SE), cùng với độ đúng, độ chụm, độ nhạy (SE%) và độ đặc hiệu (SP%).
4. Phản ứng trung hòa LSD có thể áp dụng cho những trường hợp nào?
Phương pháp được áp dụng cả với đàn chưa tiêm phòng (giúp xác định tình trạng nhiễm bệnh) và đàn đã tiêm phòng (đánh giá hiệu quả bảo hộ của vắc xin đối với chủng vi rút tại thực địa).
5. Tại sao nên sử dụng phản ứng trung hòa thay vì ELISA thông thường?
Vì phản ứng trung hòa vi rút LSD có độ đặc hiệu cao hơn, phản ánh đúng khả năng bảo hộ thực tế, trong khi ELISA chủ yếu phát hiện sự hiện diện của kháng thể mà không phản ánh hiệu lực trung hòa.

Xem thêm: 
- Định danh chủng loại vi-rút bằng giải trình tự gen trong thú y 
- Thiết lập phản ứng trung hòa định lượng kháng thể kháng Porcine Parvovirus (PPV) trên lợn
- Nuôi cấy tế bào trong sản xuất vắc xin: Quy trình, môi trường nuôi và ứng dụng thực tiễn