ĐỊNH DANH CHỦNG LOẠI VI-RÚT BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ GEN TRONG THÚ Y

Định danh chủng loại vi-rút là bước quan trọng giúp chẩn đoán chính xác, lựa chọn vắc-xin phù hợp và theo dõi sự tiến hóa của mầm bệnh trong thú y. Với sự hỗ trợ của kỹ thuật giải trình tự gen, quá trình xác định vi-rút trở nên nhanh chóng, chính xác và toàn diện hơn bao giờ hết. Phương pháp này giúp phát hiện đột biến, xác định genotype hoặc serotype đang lưu hành, từ đó cảnh báo nguy cơ dịch bệnh và xây dựng chiến lược phòng bệnh hiệu quả. Tại Fivevet, quy trình định danh vi-rút được thực hiện bài bản từ khâu tách chiết axit nucleic, PCR khuếch đại gen mục tiêu, giải trình tự bằng phương pháp Sanger, đến phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên biệt như BioEdit và MEGA X. Đây là giải pháp thiết yếu trong nghiên cứu, sản xuất vắc-xin và kiểm soát dịch bệnh cho đàn vật nuôi, góp phần bảo vệ an toàn sinh học trong chăn nuôi hiện đại.

I. Định danh chủng loại vi-rút là gì và vì sao quan trọng?
1.1. Vai trò trong chẩn đoán và phòng bệnh
Việc xác định và phân loại các tác nhân gây bệnh do vi-rút giúp các bác sĩ chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa các bệnh truyền nhiễm ở nhiều loài động vật khác nhau.
Việc định danh chủng loại vi-rút tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân biệt giữa các chủng vi-rút có quan hệ gần gũi, xác định mức độ gây bệnh, hướng dẫn lựa chọn vắc-xin và cho phép theo dõi sự tiến hóa và mô hình lây truyền của vi-rút. Đặc biệt, việc định danh có thể giúp phát hiện các chủng loại vi-rút mới.
1.2. Tác động đến lựa chọn vắc-xin và kiểm soát dịch tễ
Ứng dụng định danh chủng loại vi-rút gây bệnh bằng kĩ thuật giải trình tự gen giúp phát hiện đột biến, sai khác trong trình tự nucleotide hoặc acid-amin trong đoạn gen của vi sinh vật. Từ đó, phân tích phả hệ xác định genotype hoặc serotype lưu hành, phân tích mức độ tương đồng của chủng xét nghiệm với các chủng tham chiếu đã công bố. Từ đó đưa ra cảnh báo, chiến lược sử dụng vắc-xin phòng bệnh thích hợp đối với đàn vật nuôi. Đồng thời, xây dựng bản đồ dịch tễ theo không gian và thời gian của các chủng vi sinh vật lưu hành tại thực địa.
Trong nghiên cứu vắc-xin, việc giải trình tự giúp nhận diện sự biến đổi gen của các tác nhân gây bệnh, từ đó giúp phát hiện các chủng vi-rút hoặc vi khuẩn mới ứng dụng trong nghiên cứu tạo chủng cho sản xuất vắc-xin sử dụng chủng lưu hành tại thực địa. Ngoài ra, xác định đoạn gene quan trọng trong miễn dịch là tiền đề phát triển vắc-xin tái tổ hợp.

II. Các kỹ thuật phổ biến trong định danh vi-rút
Các phương pháp định danh chủng loại vi-rút truyền thống bao gồm phân loại dựa trên huyết thanh học sang các kỹ thuật phân tử phức tạp, bao gồm phản ứng chuỗi polymerase (PCR), giải trình tự gen, công nghệ giải trình tự và các công cụ tin sinh học tiên tiến có thể cung cấp khả năng phân tích đặc tính vi-rút nhanh chóng, chính xác và toàn diện.

III. Các bước thực hiện định danh chủng loại vi-rút
Dưới đây là quy trình thực hiện việc định danh chủng loại vi-rút gây bệnh truyền nhiễm bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
Bước 1: Tách chiết axit nucleic từ mẫu thu thập
Chiết xuất axit nucleic vi-rút (DNA hoặc RNA) từ các mẫu lâm sàng là bước đầu tiên trong quá trình định danh vi-rút. Quy trình này thường sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất thương mại để thu thập genome của hạt vi-rút và làm sạch vật liệu di truyền đồng thời loại bỏ các mảnh vụn tế bào, protein và các chất gây ô nhiễm khác. Sau khi tách chiết mẫu, nồng độ và chất lượng tinh sạch của DNA/RNA sẽ được kiểm tra bằng máy Nanodrop nhằm đảm bảo axit nucleic đạt chất lượng, trước khi thực hiện các bước tiếp theo.
Bước 2: Khuếch đại gen mục tiêu bằng phương pháp PCR
Đầu tiên cần xác định gen giải trình tự. Các gen được lựa chọn làm mục tiêu để giải trình tự định chủng vi-rút thường có những đặc điểm sau:
a. Đặc hiệu cho chủng vi-rút: Gen đó cần có những đặc trưng riêng biệt giúp phân biệt được các chủng hoặc dòng khác nhau của vi-rút.
b. Bảo tồn nhưng có biến dị phù hợp: Gen phải có vùng bảo tồn để dễ dàng thiết kế mồi (primer) trong PCR, tuy nhiên cũng cần có đủ biến dị (đột biến) để phân biệt các chủng khác nhau.
c. Chiều dài gen phù hợp: Thông thường gen có kích thước vừa phải, không quá dài để dễ dàng giải trình tự nhanh chóng và chính xác. Đặc biệt là khi giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger, không nên chọn đoạn gen dài hơn 1000 bp để giải trình tự.
d. Ý nghĩa chức năng: Các gen mã hóa cho các protein quan trọng như capsid, envelope, polymerase thường được lựa chọn bởi vì chúng liên quan trực tiếp đến đặc tính sinh học và biến dị của vi-rút.
e. Khả năng tái tổ hợp thấp: Tránh các gen dễ bị tái tổ hợp nhiều, vì điều này có thể làm sai lệch kết quả định chủng.
Sau khi đã lựa chọn được gen mục tiêu tương ứng, sẽ tiếp tục thiết kế mồi để nhân bản gen lên. Cuối cùng, thực hiện phản ứng PCR hoặc RT-PCR tùy theo hệ gen của vi-rút là DNA hay RNA.

Minh họa phản ứng polymerase Chain Reaction (PCR)
 

Trước khi gửi đi giải trình tự, cần phải điện di để kiểm tra kích thước band sản phẩm. Mẫu được gọi là đạt chuẩn là khi điện di thì chỉ lên 1 band sản phẩm PCR đúng kích thước, không lên band phụ. Nếu lên nhiều band phụ, cần phải cắt band chính và thôi gel để thu được sản phẩm tinh sạch.
Bước 3: Giải trình tự gen
Sản phẩm PCR sẽ được gửi đi các công ty để tiến hành giải trình tự gen. Các phương pháp giải trình tự gen phổ biến hiện nay bao gồm phương pháp giải trình tự gen Sanger, phương pháp giải trình tự gen NGS (next-generation sequencing) và phương pháp giải trình tự gen WGS (Whole genome sequencing). Tùy theo đoạn gen đích mà sẽ có những phương pháp giải trình tự gen phù hợp, phổ biến nhất là giải trình tự gen Sanger rất phù hợp với những đoạn gen kích thước khoảng 1 kb và phương pháp này cũng tối ưu về mặt chi phí.

Bước 4: Xây dựng cây chủng loại phát sinh loài
Trình tự gen vi-rút đã được lắp ráp sẽ được so sánh với các cơ sở dữ liệu tham chiếu toàn diện như GenBank, NCBI Vi-rút hoặc các cơ sở dữ liệu vi-rút chuyên biệt bằng các thuật toán căn chỉnh trình tự như BLAST. Những so sánh này xác định các họ hàng di truyền gần nhất và cung cấp phân loại phân loại ban đầu.
Đi sâu vào việc phân tích trình tự chi tiết bằng các phần mềm chuyên dụng như Bioedit, Clustal W giúp xác định các dấu hiệu di truyền cụ thể xác định chủng vi-rút, bao gồm đa hình nucleotide đơn, chèn, xóa và các biến thể cấu trúc. Sự khác nhau trong trình tự acid amin do nucleotide mã hóa có thể xác định miền chức năng và đánh giá tác động tiềm ẩn của các biến thể vi-rút này.

Minh họa quá trình so sánh trình tự nucleotide bằng phần mềm BioEdit
 

Sau khi đã có cơ sở dữ liệu của các chủng vi-rút khác, có thể dùng các phần mềm chuyên biệt như MEGA X để xây dựng cây chủng loại, nhằm biết được vi-rút đang phân tích thuộc genotype nào.

Sau khi đã xác định được chủng vi-rút gây bệnh trên thú y thuộc genotype nào, nên đánh giá mức độ nguy hiểm, khả năng lây lan và tác động của chủng đó lên đàn vật nuôi. Đồng thời, so sánh với các chủng đã biết để hiểu rõ hơn về nguy cơ dịch bệnh. Việc xác định được chủng vi-rút mong muốn đang thuộc genotype nào giúp xác định vắc-xin phù hợp với genotype đó. Nếu chưa có vắc-xin tương thích, có thể cần phải phát triển vắc-xin mới hoặc áp dụng các biện pháp kiểm soát khác.

IV. Ứng dụng của định danh vi-rút trong thực tiễn
Tại công ty Cổ phần Thuốc Thú Y Trung Ương 5 (Fivevet), kỹ thuật giải trình tự một đoạn gene hoặc toàn bộ gene của vi khuẩn, vi-rút được triển khai thực tế trong công tác định danh chủng loại vi-rút ở vật nuôi. Quá trình này bao gồm:
- Thiết lập mồi giải trình tự từng đoạn gene quan trọng của vi sinh vật và khuếch đại đoạn gene cho giải trình tự.
- Phân tích sự sai khác nucleotid, sai khác acid amine và đánh giá mức độ tương đồng với các chủng lưu hành tại Việt Nam, trên thế giới và chủng tham chiếu vắc-xin. 
- Đánh giá độc lực ở một số chủng vi sinh vật dựa trên biến đổi liên quan đến acid amine.
- Phân tích phát sinh loài dựa trên cây phả hệ định danh genotype và serotype.
Các dịch vụ giải trình tự hiện có tại Fivevet của các vi sinh vật được thể hiện chi tiết trong bảng dưới đây, bao gồm nhiều chủng vi-rút phổ biến trên gia súc, gia cầm và thú cưng.
 

Bảng dịch vụ giải trình tự tại công ty Fivevet
 

TT	Nội dung	Tác nhân gây bệnh	Đoạn gene	Full gene
I	Vi khuẩn
		IC (bệnh phù đầu gà)	EGFB, 16S	x
		RA (vi khuẩn bại huyết trên gia cầm)	16S	x
II	Vi-rút
2.1	Trên gia cầm
		IBV (viêm phế quản  truyền nhiễm)	S1	x
		Cúm gia cầm	H, N	x
		Newcastle trên gà	F	x
		IBD (Gumboro trên gà)	VP2	x
2.2	Trên chó mèo
		CPV (Parvovirus ở chó)	VP2	x
2.3	Trên lợn
		PRRS (Tai xanh)	ORF5	x
		PCV2 (Vi-rút gây hội chứng còi cọc ở lợn)	ORF1, ORF2	x
		PEDV (Vi-rút gây tiêu chảy thành dịch)	S1	x
2.4	Trên trâu bò
		LSD (viêm da nổi cục ở bò)	GPCR, RPO30, P32, LSD-126	x
2.5	Chung (trâu bò, lợn)
		FMD (long móng lở mồm)	VP1	x

Việc định danh chủng loại vi-rút thông qua kỹ thuật giải trình tự gen đang trở thành gải pháp hữu hiệu đối với việc phòng và kiểm soát dịch bệnh thú y. Nhờ khả năng xác định chính xác chủng vi-rút, phân tích biến dị gen và đánh giá mức độ tương đồng với các chủng tham chiếu, kỹ thuật này mở ra hướng tiếp cận toàn diện đối với việc chẩn đoán, lựa chọn vắc-xin thích hợp và theo dõi dịch tễ. Trong bối cảnh ngành chăn nuôi đối mặt với nhiều thách thức từ các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, việc ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại như giải trình tự gen không những nâng cao hiệu quả phòng bệnh mà còn góp phần bảo đảm an toàn sinh học, phát triển chăn nuôi bền vững và ổn định lâu dài. Đây chính là bước tiến cần thiết trong kỷ nguyên nông nghiệp công nghệ cao.

Câu hỏi thường gặp
1. Định danh chủng loại vi-rút là gì?
Định danh chủng loại vi-rút là quá trình xác định chính xác loại, dòng hoặc biến thể của vi-rút gây bệnh, thường dựa trên phân tích trình tự gen. Việc này giúp nhận diện vi-rút nhanh chóng, chính xác để phục vụ cho việc điều trị và phòng bệnh hiệu quả.
2. Kỹ thuật nào được sử dụng để định danh vi-rút?
Hiện nay, giải trình tự gen là kỹ thuật phổ biến và hiệu quả nhất. Ngoài ra còn có PCR, RT-PCR, phân tích phả hệ bằng phần mềm chuyên biệt như MEGA X, BioEdit giúp xây dựng cây chủng loại và xác định genotype hoặc serotype.
3. Định danh vi-rút có giúp lựa chọn vắc-xin chính xác hơn không?
Có. Việc xác định đúng chủng vi-rút giúp so sánh với các chủng tham chiếu vắc-xin đã công bố. Từ đó, người chăn nuôi và bác sĩ thú y có thể chọn loại vắc-xin tương thích, tăng hiệu quả phòng bệnh.
4. Việc định danh vi-rút được thực hiện trong những trường hợp nào?
Kỹ thuật này được sử dụng khi phát hiện các trường hợp nhiễm bệnh không điển hình, nghi ngờ có chủng vi-rút mới, hoặc để tìm nguyên nhân dịch bệnh trong chăn nuôi.
5. Định danh chủng loại vi-rút có tốn kém không?
Chi phí tùy thuộc vào loại vi-rút, phương pháp giải trình tự và độ phức tạp của mẫu. Tuy nhiên, với sự phát triển của công nghệ, chi phí này đang ngày càng hợp lý và phù hợp để ứng dụng rộng rãi trong thực tế.

Xem thêm:
- Phương pháp giải trình tự gen và ứng dụng trong thú y
- Hướng dẫn thiết kế mồi PCR trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm ở thú y chuẩn chính xác
- Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vắc xin PCV2 phòng hội chứng còi cọc trên lợn