I. Mở đầu
Trong lĩnh vực công nghệ sinh học và sản xuất vắc xin hiện đại, công nghệ nuôi cấy tế bào đóng vai trò nền tảng vô cùng quan trọng. Nhiều loại vắc xin vi rút hiện nay được nghiên cứu và sản xuất thông qua quá trình nuôi cấy vi rút trên các dòng tế bào động vật - nơi vi rút có thể nhân lên và biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu. Chính vì vậy, chất lượng tế bào nuôi cấy ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất sản xuất, tính ổn định, độ an toàn và hiệu quả của vắc xin thành phẩm.
Tuy nhiên, nuôi cấy tế bào là một quy trình phức tạp và nhạy cảm, đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ nhiều yếu tố kỹ thuật như: nguồn gốc tế bào, đặc điểm sinh học, điều kiện nuôi cấy, thiết bị sử dụng và thao tác kỹ thuật viên. Chỉ một sai lệch nhỏ trong các khâu này cũng có thể gây ra sự không ổn định của tế bào, mất kiểu hình, hoặc thậm chí thất bại trong thí nghiệm và sản xuất.
Vì vậy, đảm bảo chất lượng trong nuôi cấy tế bào là yếu tố then chốt trong toàn bộ chuỗi quy trình nghiên cứu và sản xuất vắc xin. Việc xây dựng hệ thống kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt, giám sát liên tục quy trình nuôi cấy và tuân thủ các quy định an toàn sinh học là điều kiện tiên quyết để đảm bảo mỗi lô vắc xin được sản xuất ra đều đạt chuẩn về hiệu quả và an toàn sinh học. Ở bài viết này, Fivevet chia sẻ “Tối ưu quy trình nuôi cấy tế bào: Những lưu ý quan trọng để đảm bảo chất lượng và an toàn sinh học”, giúp người chăn nuôi và các đơn vị nghiên cứu hiểu rõ hơn về tầm quan trọng của việc kiểm soát chất lượng trong từng giai đoạn nuôi cấy tế bào.
Quy trình nuôi cấy tế bào
II. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nuôi cấy tế bào
1. Các điều kiện nuôi cấy
1.1. Độ pH của môi trường nuôi cấy
Hầu hết các dòng tế bào động vật có vú bình thường phát triển tốt trong môi trường có pH khoảng 7,4 và sự khác biệt giữa các dòng tế bào là không đáng kể. Tuy nhiên, một số dòng tế bào biến đổi (transformed cell lines) lại sinh trưởng tốt hơn trong môi trường hơi acid nhẹ (pH 7,0-7,4). Ngược lại, các dòng tế bào nguyên bào sợi bình thường (fibroblast) thường ưa môi trường có tính kiềm nhẹ (pH 7,4-7,7).
Đa số các môi trường nuôi cấy tế bào đều chứa phenol red - một chất chỉ thị pH giúp nhận biết sự thay đổi độ acid-kiềm. Khi mở nắp chai môi trường nhiều lần, pH có thể thay đổi do hấp thụ CO₂ hoặc tiếp xúc không khí, dẫn đến biến đổi màu sắc từ đỏ sang tím, phản ánh sự thay đổi pH của môi trường.
Màu sắc và độ PH của môi trường nuôi cấy
Thông thường, tế bào chỉ phát triển ổn định trong khoảng pH 7,2-7,4. Nếu nhận thấy môi trường bị thay đổi độ pH, cần thay bằng môi trường mới để đảm bảo điều kiện nuôi cấy tối ưu. Trong trường hợp hiện tượng này xảy ra thường xuyên, nên pha môi trường với thể tích nhỏ hơn nhằm sử dụng hết trước khi pH bị biến đổi.
1.2. CO2 và vai trò trong điều chỉnh pH
Trong hệ đệm bicarbonate - CO₂, pH môi trường phụ thuộc vào sự cân bằng giữa CO₂ hòa tan và bicarbonate (HCO₃⁻). Do đó, thay đổi nồng độ CO₂ trong không khí có thể làm biến đổi pH.
Thông thường, 5-7% CO₂ được dùng trong nuôi cấy tế bào, nhưng tùy loại tế bào và môi trường, có thể điều chỉnh trong khoảng 4-10% CO₂. Các tủ ấm nuôi cấy được trang bị hệ thống duy trì CO₂ ổn định để kiểm soát pH.
Khi dùng chai nuôi cấy nắp kín, cần nới lỏng nắp trước khi đặt vào tủ ấm để khí CO₂ cân bằng. Nếu dùng chai nắp lọc khí, không cần mở nắp vì đã có khả năng trao đổi khí.
1.3. Nhiệt độ
Trong nuôi cấy tế bào, nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào nhiệt độ cơ thể của loài vật chủ mà tế bào được lấy ra. Với tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp thường là 37°C.
Tăng nhiệt quá mức gây ảnh hưởng nghiêm trọng hơn so với thiếu nhiệt, có thể làm biến đổi môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng đến độ ẩm và pH của môi trường, từ đó làm giảm khả năng phát triển của tế bào.
Do đó, tủ ấm nuôi cấy tế bào luôn được cài đặt chính xác ở nhiệt độ tối ưu, hoặc thấp hơn một chút để tránh hiện tượng quá nhiệt, đảm bảo điều kiện ổn định cho tế bào phát triển.
Tủ ấm 37oC có bổ sung 5% CO2 trong không khí
1.4. Nội độc tố
Nội độc tố có thể được giải phóng trong quá trình vi khuẩn phát triển hoặc phân hủy. Dù ở nồng độ rất thấp, nội độc tố vẫn có thể ảnh hưởng tiêu cực đến tế bào, gây phản ứng viêm, stress oxy hóa, giảm khả năng sống, gây apoptosis, đồng thời ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh, biệt hóa và biểu hiện protein.
Các tế bào miễn dịch, tế bào gốc và tế bào sử dụng trong chuyển gen, vectơ vi rút đặc biệt nhạy cảm với nội độc tố. Nguồn ô nhiễm nội độc tố thường đến từ nước, môi trường nuôi cấy, huyết thanh, dụng cụ thí nghiệm, quá trình tiệt trùng không đúng cách hoặc thao tác vô trùng kém.
Ngăn ngừa rủi ro do nội độc tố trong nuôi cấy tế bào không khó, nhưng cần kiểm soát chặt chẽ và tuân thủ nghiêm ngặt quy trình vô trùng:
- Sử dụng nước siêu lọc để pha môi trường và hóa chất.
- Chọn huyết thanh FBS chất lượng cao, ít nội độc tố: đây là nguồn nhiễm phổ biến nhất. Ưu tiên các lô FBS được kiểm tra và chứng nhận có mức nội độc tố dưới 10 EU/mL cho ứng dụng thông thường và dưới 1 EU/mL cho các thí nghiệm nhạy cảm.
- Tuân thủ quy tắc an toàn sinh học, đảm bảo môi trường, dụng cụ và thao tác luôn vô trùng trong suốt quá trình nuôi cấy.
2. Các thông số cần lưu ý
2.1. Số lần cấy chuyển (Passage Number)
Số lần cấy chuyền là thông số cho biết tế bào đã được nhân chuyền bao nhiêu lần kể từ khi được phân lập ban đầu hoặc rã đông từ ống giống. Mỗi lần cấy chuyền đại diện cho một chu kỳ phát triển và nhân lên của tế bào.
Trong quá trình nuôi cấy kéo dài, tế bào có thể tích lũy các biến đổi ở cấp độ phân tử và biểu sinh, dẫn đến thay đổi hình thái, tăng sinh chậm lại, giảm khả năng sống sót hoặc biệt hóa không mong muốn, dù hình thái tế bào bên ngoài có thể không thay đổi. Vì vậy, số lần cấy chuyền là chỉ số quan trọng giúp đánh giá chất lượng tế bào, hiệu suất hoạt động và độ tin cậy của kết quả thí nghiệm.
Số lần cấy chuyền tế bào
Tế bào chỉ ổn định trong một giới hạn đời cấy chuyền nhất định. Khi vượt quá giới hạn này, chúng có thể thoái hóa hoặc xuất hiện biến đổi di truyền. Việc theo dõi số lần cấy chuyền giúp xác định thời điểm cần rã đông hoặc phân lập dòng tế bào mới, loại bỏ tế bào đã thoái hóa và xác định nguyên nhân thay đổi hình thái trong quá trình nuôi cấy.
2.2. Mật độ gieo tế bào nuôi cấy
Mật độ tế bào là số lượng tế bào được cấy trên một đơn vị thể tích môi trường nuôi cấy; với tế bào bám dính, đó là số lượng tế bào trên một đơn vị diện tích bề mặt. Việc duy trì mật độ tế bào phù hợp giúp tế bào tận dụng tối ưu oxy và chất dinh dưỡng, duy trì hình thái – chức năng ổn định, đồng thời đảm bảo tính đồng nhất giữa các đời cấy chuyền.
Khi mật độ tế bào quá cao, tế bào dễ bị ức chế phát triển và thoái hóa sớm do thiếu hụt dinh dưỡng và oxy trong môi trường nuôi cấy. Với những dòng tế bào phát triển nhanh, kích thước lớn như PK15, cần gieo ở mật độ thưa hơn so với các dòng khác (ví dụ khoảng 1×10⁵ cells/ml) để tế bào có đủ không gian phát triển.
Ngược lại, nếu mật độ quá thấp, tế bào có thể chịu stress, tăng trưởng chậm hoặc thay đổi hình thái. Một số dòng ưa mật độ cao, chẳng hạn Marc-145, được khuyến nghị gieo ở mật độ khoảng 2×10⁵ cells/ml để đạt khả năng sinh trưởng tối ưu. Tương tự, các dòng BHK21, ST,… cũng thường được duy trì ở mật độ 2×10⁵ cells/ml trong quá trình nuôi cấy.
Hình ảnh tế bào BHK21 khi gieo ở mật độ 2.105 cells/1ml
Một trong số các phương pháp phổ biến để xác định mật độ tế bào là sử dụng buồng đếm Neubauer.
Hình minh họa buồng đếm Neubauer cải tiến
Mật độ tế bào (A) được tính khi sử dụng buồng đếm Neubauer
Các thao tác khi quan sát và xác định mật độ tế bào đóng vai trò rất quan trọng, vì chúng quyết định mật độ gieo tế bào cho đời cấy chuyền tiếp theo.
2.3. Tỷ lệ che phủ bề mặt nuôi cấy
Tỷ lệ che phủ (bám đáy) của tế bào khi được gieo với mật độ phù hợp sẽ phản ánh chất lượng tế bào, xác định thời điểm cấy chuyền và sử dụng cho thí nghiệm.
Tỷ lệ tế bào BHK21 bám đáy
Tỷ lệ che phủ (bám đáy) sẽ tùy theo mục đích sử dụng tế bào.
Mục đích sử dụng tế bào
2.4. Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
Tạp nhiễm Mycoplasma ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh lý, di truyền và tốc độ tăng trưởng của tế bào, gây sai lệch kết quả thí nghiệm sinh học phân tử, miễn dịch học và dược lý học. Mặc dù có thể khử nhiễm Mycoplasma tuy nhiên chất lượng tế bào về sau cũng có thể bị ảnh hưởng, vậy nên các phương pháp phát hiện tạp nhiễm Mycoplasma vẫn được đề cao hơn.
Các phương pháp kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma thường được sử dụng là PCR, Nhuộm huỳnh quang,...
Tần suất kiểm tra Mycoplasma
III. Kết luận
Nuôi cấy tế bào là một mắt xích quan trọng và không thể tách rời trong quy trình sản xuất vắc xin hiện đại. Việc đảm bảo chất lượng trong suốt quá trình này đóng vai trò then chốt, quyết định đến hiệu quả, độ an toàn và tính ổn định của sản phẩm cuối cùng. Chỉ khi tế bào được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu và kiểm soát nghiêm ngặt, mới có thể đảm bảo rằng các kháng nguyên sinh học được tạo ra đạt chất lượng cao và đáp ứng tiêu chuẩn sản xuất công nghiệp.
Câu hỏi thường gặp:
1. Nuôi cấy tế bào là gì?
Nuôi cấy tế bào là quá trình duy trì và phát triển tế bào trong điều kiện nhân tạo (in vitro), nhằm tạo môi trường sinh trưởng tối ưu cho tế bào phục vụ nghiên cứu, sản xuất vắc xin và dược phẩm sinh học.
2. Vì sao nuôi cấy tế bào quan trọng trong sản xuất vắc xin?
Đây là khâu nền tảng để nhân lên vi rút hoặc sản xuất kháng nguyên. Chất lượng tế bào quyết định trực tiếp đến hiệu quả, độ an toàn và tính ổn định của vắc xin thành phẩm.
3. Những yếu tố nào ảnh hưởng đến chất lượng nuôi cấy tế bào?
Các yếu tố chính gồm: nguồn giống tế bào, mật độ gieo, điều kiện môi trường (pH, CO₂, nhiệt độ), độ sạch và tạp nhiễm (đặc biệt là Mycoplasma).
4. Tạp nhiễm Mycoplasma ảnh hưởng gì đến quá trình nuôi cấy tế bào?
Tạp nhiễm Mycoplasma làm thay đổi sinh lý, di truyền và tốc độ tăng trưởng của tế bào, gây sai lệch kết quả thí nghiệm và ảnh hưởng đến chất lượng kháng nguyên trong sản xuất vắc xin.
5. Làm thế nào để phát hiện tạp nhiễm Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào?
Các phương pháp phổ biến là PCR và nhuộm huỳnh quang, giúp phát hiện nhanh, chính xác sự hiện diện của Mycoplasma trong mẫu nuôi cấy.
Xem thêm:
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
