PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN VÀ ỨNG DỤNG TRONG THÚ Y

1. Tổng quan về giải trình tự gen
1.1.  Nguyên lý của phương pháp giải trình tự gen
DNA (deoxyribonucleic acid hay AND) là phân tử mang thông tin di truyền quy định mọi hoạt động sống (sinh trưởng, phát triển và sinh sản) của các sinh vật và nhiều loài vi rút. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các bazơ của chúng, đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định.
Giải trình tự gen là việc xác định thứ tự của các khối cấu tạo hoá học, được gọi là bazơ, tạo nên phân tử DNA. Thông qua giải trình tự gen sẽ giúp các nhà khoa học biết được trong 1 đoạn DNA cụ thể có mang loại thông tin di truyền nào không. Ngoài ra, các dữ liệu giải trình tự gen cũng giúp làm nổi bật những thay đổi trong gen có thể gây ra bệnh.
1.2. Các phương pháp giải trình tự phổ biến hiện nay
1.2.1. Giải trình tự bằng phương pháp Sanger
Kỹ thuật này được Frederick Sanger phát triển vào năm 1977 và đã trở thành nền tảng cho việc giải trình tự DNA trong nhiều năm. Sanger sequencing có độ chính xác rất cao và lý tưởng để giải trình tự các vùng DNA nhỏ hoặc các đoạn gen đích. Nó được sử dụng để giải trình tự các gen, phát hiện đột biến và xác nhận kết quả từ các phương pháp giải trình tự thế hệ tiếp theo.
Giải trình tự Sanger có thể thực hiện với các đoạn DNA tương đối dài (khoảng 900 cặp base). Phương pháp này thường được sử dụng để sắp xếp các DNA riêng lẻ, như plasmid vi khuẩn hoặc DNA được sao chép trong PCR.
Tuy nhiên, giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger là tốn kém và không hiệu quả cho các dự án có quy mô lớn hơn, như trình tự toàn bộ hệ gen hay metagenome.

1.2.2. Giải trình tự bằng phương pháp NGS
Giải trình tự gen thế hệ mới NGS (Next Generation Sequencing) ra đời năm 2004 hay còn được biết đến với tên gọi giải trình tự băng thông rộng (Massive Parallel Sequencing - MPS) 2004 đã giúp các nhà nghiên cứu hiểu sâu hơn về các bệnh di truyền.
Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) là công nghệ có khả năng giải mã hàng triệu đoạn DNA cùng lúc, góp phần thúc đẩy hiệu suất giải mã toàn bộ hệ gen. Bên cạnh đó, công nghệ NGS còn có những lợi ích như: thời gian đọc nhanh, dữ liệu đầu ra lớn và tiết kiệm chi phí, khắc phục được những nhược điểm của phương pháp giải trình tự gen truyền thống. Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) được ứng dụng trong:
- Giải trình tự toàn bộ bộ gen: Xác định trình tự DNA hoàn chỉnh của một sinh vật.
- Giải trình tự chọn lọc: Tập trung vào các vùng cụ thể của bộ gen để phân tích chi tiết hơn.
- Giải trình tự RNA (RNA-Seq): Nghiên cứu biểu hiện gen bằng cách giải trình tự RNA.
- Metagenomics: Phân tích vật liệu di truyền của các cộng đồng vi sinh vật.
1.2.3. Giải trình tự bằng phương pháp WGS
WGS (Whole genome sequencing) là phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen để xác định tất cả các tổn thương di truyền trên toàn bộ hệ gen, bao gồm vùng mã hóa (exon) và vùng không mã hóa. Phương pháp này cung cấp cái nhìn tổng thể về cấu trúc di truyền của sinh vật, giúp phát hiện những biến thể như biến đổi một nucleotide đơn (SNP), thêm/ mất đoạn DNA và các biến thể cấu trúc có thể ảnh hưởng đến sức khỏe, nguy cơ bệnh tật và các đặc tính sinh học khác mà các phương pháp giải mã khác có thể không nhận ra.
1.3. Ứng dụng của giải trình tự gen trong thú y
Vi sinh vật bao gồm vi khuẩn và vi rút gây bệnh trên thực tế luôn có đột biến, tái tổ hợp, phát sinh genetype hoặc serotype mới. Sự biến đổi không ngừng của vi sinh vật yêu cầu có một giải pháp phát hiện sớm kịp thời đưa ra phương hướng phòng trị bệnh.
Giải trình tự hệ gen (genome sequencing) giúp người chăn nuôi, nhà nghiên cứu xác định rõ sự lưu hành thực tế chủng, biến chủng của vi sinh vật  nâng cao hiệu quả và tính chính xác trong các phương pháp điều trị, lựa chọn vắc xin trong phòng bệnh cũng như phát triển nghiên cứu sản xuất vắc xin từ chủng thực địa.
Trong chẩn đoán thú y:
- Phát hiện đột biến, sai khác trong trình tự nucleotid hoặc acid amine trong đoạn gen của vi sinh vật. Từ đó, phân tích phả hệ xác định genotype hoặc serotype lưu hành, phân tích mức độ tương đồng của chủng xét nghiệm với các chủng tham chiếu đã công bố. Từ đó đưa ra cảnh báo, chiến lược sử dụng vắc xin phòng bệnh phù hợp cho đàn vật nuôi.
- Xây dựng bản đồ dịch tễ theo không gian và thời gian của các chủng vi sinh vật lưu hành tại thực địa.
- Nhận diện sự thay đổi các đoạn gen vi khuẩn liên quan đến tính kháng kháng sinh đang được quan tâm hiện nay.
Trong nghiên cứu vắc xin:
- Giải trình tự giúp nhận diện sự biến đổi gen của các tác nhân gây bệnh, từ đó giúp phát hiện các chủng vi rút hoặc vi khuẩn mới ứng dụng trong nghiên cứu tạo chủng cho sản xuất vắc xin sử dụng chủng lưu hành tại thực địa.
- Xác định đoạn gen quan trọng trong miễn dịch là tiền đề để phát triển vắc xin tái tổ hợp.
2. Dịch vụ giải trình tự gen tại Fivevet
2.1. Ứng dụng của kĩ thuật giải trình tự định danh Genotype (Serotype) vi sinh vật (Vi khuẩn, vi rút) từ mẫu bệnh phẩm hoặc mẫu phân lập
Tại công ty Cổ phần Thuốc Thú Y Trung Ương 5, chúng tôi phát triển giải trình tự một đoạn gen hoặc toàn bộ gen của vi khuẩn vi rút như sau:
Chúng tôi thiết lập mồi giải trình tự từng đoạn gen quan trọng của vi sinh vật và khuếch đại đoạn gen cho giải trình tự.
Phân tích sự sai khác nucleotid, sai khác acid amine và đánh giá mức độ tương đồng với các chủng lưu hành tại Việt Nam, trên thế giới và chủng tham chiếu vắc xin. Một số chủng vi sinh vật có thể đánh giá độc lực dựa trên biến đổi liên quan đến acid amine.
Phân tích phát sinh loài dựa trên cây phả hệ định danh genotype và serotype.
Fivevet phát triển dịch vụ giải trình tự của các vi sinh vật theo bảng:
Bảng dịch vụ giải trình tự tại công ty Fivevet:

- Cây phả hệ liên quan đến định danh genetype và serotype cũng như phát sinh loài mới.
- Bảng đánh giá mức độ tương đồng nucleotid hoặc acid amin với các chủng tham chiếu thực địa và vắc xin.
- Đánh giá đột biến hoặc biến đổi liên quan đến nucleotid và acid amine. Từ đó,  theo dõi sự thay đổi của vi rút và đánh giá sự xuất hiện của các biến thể mới. Điều này rất quan trọng trong việc giám sát và kiểm soát các dịch bệnh.

2.2. Ứng dụng giải trình tự trong phát triển vắc xin từ chủng lưu hành tại thực địa Việt Nam
Tại phòng thí nghiệm Công ty ứng dụng giải trình tự:
Phân tích sàng lọc chủng vi sinh vật đại diện cho chủng vi sinh vật lưu hành tại thực tế cho nghiên cứu chủng sản xuất vắc xin từ chủng thực địa. Hiện phòng R&D luôn tạo ngân hàng vi sinh vật phân lập từ mẫu bệnh phẩm tại thực địa theo năm với bệnh trên lợn gồm lở mồm long móng, PCV2, PEDV, PRRS, CSF, giả dại,… gia cầm: Dịch tả vịt, IB, cúm gia cầm, IC, Newcastle,… chó mèo: Care, Parvo, vi rút tiêu chảy mèo, cúm chó mèo,...
Đánh giá mức độ biến đổi chủng trong quá trình thích nghi trên môi trường nuôi cấy và bản động vật từ đó tạo ra chủng có khả năng nhân lên tốt, có tính sinh miễn dịch đảm bảo cho sản xuất kháng nguyên vắc xin. Chúng tôi ứng dụng trong phát triển vắc xin tai xanh, vắc xin Newcastle geno type 7, vắc xin PEDV (tiêu chảy thành dịch trên lợn), vắc xin PCV2 (Hội chứng còi cọc trên lợn),… với các sản phẩm: Five-ND.IB.AI, Five-Lasota, Five-CSF, Five-Newcastle G7, Five-PRRS Gold,…
Đánh giá đoạn gen tiềm năng cho phát triển vắc xin theo công nghệ di truyền ngược (reverse genetic), vắc xin tái tổ hợp. Ứng dụng phát triển vắc xin cúm gia cầm chủng phân lập tại Việt Nam, vắc xin PCV2.
Xây dựng bản đồ dịch tễ học sự lưu hành của các chủng vi sinh vật tại thực tế theo yêu cầu khách hàng và trên ngân hàng vi sinh vật lưu trữ tại Công ty.
Xem thêm:
- Phát triển vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở gia cầm
- Vắc xin Five-Coryvac - Chủng đại diện Việt Nam
- Vắc xin dịch tả lợn và hiệu quả phòng bệnh - vắc xin Five-CSF