I. Tổng quan về phương pháp giải trình tự Sanger
Các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn và virus gây ra như: Bệnh sưng phù đầu ở gà do cozyra gây ra (IC) ở gà do vi khuẩn
Avibacterium paragallinarum, cúm gia cầm do virus cúm gia cầm (AIV), bệnh lở mồm long móng do virus FMDV hay bệnh viêm ruột do
Canine Parvovirus (CPV) luôn tiềm ẩn nguy cơ gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, sức khỏe vật nuôi và an toàn dịch bệnh.
Chẩn đoán phòng thí nghiệm hiện nay không chỉ dừng lại ở việc phát hiện vật chất di truyền của mầm bệnh bằng PCR hoặc Real-time PCR. Trong nhiều trường hợp, cần tiếp tục xác định genotype, serotype, phân tích đột biến và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus.
Giải trình tự Sanger, hay Sanger Sequencing, được Frederick Sanger và cộng sự phát triển vào năm 1977. Mặc dù thuộc công nghệ giải trình tự thế hệ thứ nhất, phương pháp này vẫn được xem là một trong những tiêu chuẩn tham chiếu quan trọng trong sinh học phân tử nhờ độ chính xác cao, thời gian phân tích tương đối nhanh và chi phí phù hợp với số lượng mẫu vừa hoặc nhỏ. Cùng
Fivevet tìm hiểu ứng dụng phương pháp giải trình tự Sanger trong chẩn đoán và nghiên cứu virus thú y trong bài viết này.
II. Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự Sanger
Phương pháp Sanger hoạt động dựa trên nguyên tắc kết thúc chuỗi bằng dideoxynucleotide, còn gọi là Chain Termination Method.
Thành phần của phản ứng giải trình tự
Một phản ứng giải trình tự Sanger thường bao gồm:
- DNA khuôn mẫu
- Một mồi đơn (Primer), có thể là mồi xuôi hoặc mồi ngược
- Enzyme DNA polymerase
- Các deoxynucleoside triphosphate thông thường gồm dATP, dTTP, dCTP và dGTP
- Một tỷ lệ nhỏ dideoxynucleoside triphosphate gồm ddATP, ddTTP, ddCTP và ddGTP được gắn nhãn huỳnh quang
Mỗi loại ddNTP đại diện cho một bazơ A, T, C hoặc G và được gắn tín hiệu huỳnh quang riêng biệt.
Cơ chế kết thúc chuỗi DNA
Cấu trúc của ddNTP thiếu nhóm 3'-OH tự do - vị trí cần thiết để tạo liên kết phosphodiester với nucleotide tiếp theo. Khi DNA polymerase gắn ngẫu nhiên một ddNTP vào chuỗi đang kéo dài, phản ứng tổng hợp lập tức dừng lại, tạo ra vô số đoạn DNA có độ dài khác nhau kết thúc tại đúng bazơ đó.
Phân tách và đọc tín hiệu huỳnh quang
Các đoạn DNA tổng hợp được phân tách theo kích thước với độ phân giải 1 nucleotide thông qua kỹ thuật điện di mao quản (Capillary Electrophoresis). Khi các đoạn đi qua chùm tia laser, nhãn huỳnh quang trên ddNTP phát quang, máy thu tín hiệu ghi nhận và chuyển đổi thành sắc đồ (Chromatogram) cùng chuỗi nucleotide tương ứng.
Giải trình tự gen bằng phương pháp Sanger
III. Quy trình giải trình tự Sanger trong chẩn đoán virus thú y
Một quy trình chẩn đoán và giám sát dịch tễ bằng phương pháp Sanger thường gồm 4 bước chính.
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và khuếch đại vùng gen mục tiêu
Vật chất di truyền được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm phù hợp. Đối với virus RNA như FMDV hoặc AIV, RNA cần được phiên mã ngược thành DNA bổ sung trước khi khuếch đại.
Mồi PCR được thiết kế đặc hiệu cho vùng gen mang thông tin phân loại hoặc có mức độ biến đổi phù hợp. Ví dụ, gen VP2 thường được sử dụng trong nghiên cứu Canine Parvovirus, trong khi trình tự gen VP1 có giá trị quan trọng đối với việc phân type và nghiên cứu virus lở mồm long móng.
Bước 2: Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR cần được loại bỏ dNTPs dư, mồi chưa liên kết và enzyme polymerase bằngg phương pháp Enzymatic như ExoSAP-IT hoặc cột lọc chuyên dụng.
Bước này ảnh hưởng trực tiếp đến độ rõ của sắc đồ và chất lượng trình tự nucleotide thu được.
Bước 3: Cycle sequencing và điện di mao quản
Sản phẩm PCR tinh sạch được đưa vào phản ứng cycle sequencing với hóa chất giải trình tự, chẳng hạn BigDye Terminator, cùng một mồi đơn theo chiều xuôi hoặc chiều ngược.
Sau phản ứng, sản phẩm tiếp tục được tinh sạch, biến tính và đưa vào hệ thống phân tích di truyền tự động như ABI 3500 để thực hiện điện di mao quản và ghi nhận tín hiệu huỳnh quang.
Bước 4: Phân tích dữ liệu sinh học phân tử
Các phần mềm như BioEdit, CLC Genomics Workbench hoặc MEGA có thể được sử dụng để kiểm tra chất lượng sắc đồ (phát hiện đỉnh kép, độ nhiễu background).
Trình tự đạt chất lượng được gióng hàng và so sánh với dữ liệu trên NCBI GenBank thông qua công cụ BLAST. Kết quả giúp xác định loài, genogroup và các đột biến nucleotide.
IV. Ưu điểm và hạn chế của giải trình tự Sanger
Dưới đây là bảng tổng hợp so sánh các đặc tính kỹ thuật của giải trình tự Sanger trong ứng dụng thực tế:
Ưu điểm và hạn chế của giải trinh tụ Sanger
V. Ứng dụng thực tiễn của giải trình tự Sanger
Phân loại genotype và giám sát biến chủng
Giải trình tự các đoạn gen bảo tồn hoặc biến đổi (như gen VP2 của Parvovirus, gen type O, A, ASIA trên FMDV) giúp phân loại chính xác genotype
Phân tích dịch tễ học phân tử (Molecular Epidemiology)
Dữ liệu nucleotide là cơ sở để xây dựng cây phát sinh loài (Phylogenetic tree). Qua đó, cơ quan chuyên môn có thể đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các chủng, truy xuất nguồn gốc ổ dịch và nghiên cứu đường lây truyền giữa các trang trại hoặc khu vực.
Phát hiện đột biến và hiện tượng tái tổ hợp
Phương pháp Sanger có thể phát hiện các đột biến điểm (SNPs) trong đoạn gen mục tiêu, bao gồm những thay đổi liên quan đến đặc tính kháng nguyên, khả năng thích nghi hoặc liên quan đến sự kháng thuốc kháng diệt virus.
Khi nghi ngờ hiện tượng tái tổ hợp, dữ liệu Sanger có thể cung cấp thông tin ban đầu. Tuy nhiên, phân tích toàn bộ hệ gen bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới thường cần thiết để đánh giá đầy đủ hơn.
Thẩm định kết quả xét nghiệm
Giải trình tự Sanger được sử dụng để kiểm chứng những kết quả PCR hoặc Real-time PCR chưa rõ ràng, chẳng hạn tín hiệu Cq xuất hiện muộn, phản ứng không điển hình hoặc nghi ngờ âm tính giải do đột biến tại vùng gắn mồi.
VI. Vai trò của Sanger trong phòng xét nghiệm thú y
Các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS - Next-Generation Sequencing) như Illumina và Oxford Nanopore ngày càng phát triển, đặc biệt trong nghiên cứu toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing) và phân tích số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, giải trình tự Sanger vẫn giữ vai trò quan trọng trong các phòng xét nghiệm thú y thường quy.
Nhờ độ chính xác cao, thời gian thực hiện nhanh và chi phí phù hợp đối với đoạn gen mục tiêu, phương pháp này tiếp tục hỗ trợ hiệu quả việc định danh, phân type, giám sát biến đổi di truyền và kiểm chứng kết quả xét nghiệm virus.
Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet).
Câu hỏi thường gặp
1. Giải trình tự Sanger có dùng để phát hiện virus trực tiếp không?
Thông thường, mẫu cần được xét nghiệm và khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng PCR hoặc RT-PCR trước khi thực hiện giải trình tự Sanger.
2. Sanger có thể giải trình tự toàn bộ hệ gen virus không?
Có thể trong một số trường hợp bằng cách chia hệ gen thành nhiều đoạn chồng lấp, nhưng phương pháp này kém thuận tiện hơn NGS đối với hệ gen lớn hoặc số lượng mẫu nhiều.
3. Kết quả Sanger có thể xác định chính xác chủng virus không?
Kết quả có thể hỗ trợ xác định loài, genotype hoặc mức độ tương đồng, tùy thuộc vùng gen được lựa chọn và chất lượng cơ sở dữ liệu tham chiếu.
4. Vì sao sắc đồ Sanger xuất hiện đỉnh kép?
Đỉnh kép có thể liên quan đến mẫu chứa nhiều trình tự, vị trí biến thể, sản phẩm PCR không đặc hiệu hoặc chất lượng mẫu và phản ứng giải trình tự chưa đạt yêu cầu.
5. Khi nào nên lựa chọn Sanger thay vì NGS?
Sanger phù hợp khi cần phân tích một số đoạn gen đã xác định trên số lượng mẫu vừa hoặc nhỏ. NGS phù hợp hơn với nghiên cứu toàn hệ gen, phát hiện tác nhân chưa biết hoặc phân tích đồng thời nhiều trình tự.
Xem thêm:
-
Chứng nội tại trong PCR là gì?
-
ỨNG DỤNG HỆ THỐNG BIỂU HIỆN BACULOVIRUS NHẰM SẢN XUẤT PROTEIN CAP TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS PCV2 GÂY BỆNH TRÊN LỢN
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
