ỨNG DỤNG HỆ THỐNG BIỂU HIỆN BACULOVIRUS NHẰM SẢN XUẤT PROTEIN CAP TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS PCV2 GÂY BỆNH TRÊN LỢN

Porcine circovirus type 2, viết tắt là PCV2, là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng trong ngành chăn nuôi lợn. Virus này có liên quan đến hội chứng suy giảm đa hệ thống sau cai sữa, còn gọi là PMWS, cùng nhiều rối loạn miễn dịch khác trên đàn lợn.
Bộ gen của PCV2 là DNA vòng sợi đơn, có kích thước khoảng 1,7 kb và gồm nhiều khung đọc mở, gọi là ORFs. Trong đó, ORF2 là gen quan trọng nhất vì mã hóa protein capsid, hay còn gọi là protein Cap (Chen et al., 2020; Lekcharoensuk et al., 2004). Đây là thành phần cấu trúc chính của virus và có vai trò đặc biệt trong nghiên cứu phát triển vắc xin phòng PCV2.
Protein Cap không chỉ tham gia cấu tạo vỏ virus mà còn chứa các epitope kháng nguyên chủ yếu. Đặc biệt, protein này có khả năng tự lắp ráp thành các cấu trúc giống virus, gọi là virus-like particles hoặc VLPs. Chính vì vậy, ORF2 được xem là mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu vắc xin tiểu đơn vị và vắc xin tái tổ hợp chống PCV2 (Cao et al., 2019). 
Tại Fivevet, việc nghiên cứu và ứng dụng các nền tảng công nghệ sinh học hiện đại như hệ thống biểu hiện Baculovirus có ý nghĩa quan trọng trong định hướng làm chủ công nghệ sản xuất vắc xin thú y. Đây là cơ sở để phát triển các giải pháp phòng bệnh an toàn, hiệu quả và phù hợp với thực tiễn chăn nuôi lợn tại Việt Nam.

Hệ thống biểu hiện Baculovirus, hay Baculovirus Expression Vector System, viết tắt là BEVS, là một nền tảng mạnh trong công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt trong sản xuất protein tái tổ hợp và vắc xin. Nhờ khả năng biểu hiện protein với hiệu suất cao trong tế bào côn trùng và khả năng gắn các biến đổi sau dịch mã tương tự sinh vật nhân chuẩn, baculovirus đã trở thành công cụ quan trọng để phát triển vắc xin thế hệ mới, bao gồm vắc xin tiểu đơn vị, vắc xin dạng hạt giống virus (VLP) và vector vắc xin.
Trong bối cảnh các bệnh truyền nhiễm ngày càng phức tạp, nhu cầu phát triển vắc xin an toàn, hiệu quả và có khả năng sản xuất nhanh là rất cấp thiết. Hệ thống biểu hiện baculovirus là một nền tảng mạnh mẽ cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với cấu trúc gần giống tự nhiên trong tế bào nhân chuẩn.
Baculovirus thường được sử dụng là Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Hệ thống này hoạt động dựa trên việc chèn gen mục tiêu (ORF2) vào bộ gen baculovirus dưới sự kiểm soát của promoter mạnh như polyhedrin hoặc p10. Sau khi tái tổ hợp, baculovirus sẽ nhiễm vào tế bào côn trùng và biểu hiện protein với hiệu suất cao  (Ye et al., 2013).
Ưu điểm của hệ thống baculovirus bao gồm:
-  Khả năng biểu hiện protein ở mức cao
- Gấp cuộn protein và biến đổi hậu dịch mã gần với tế bào nhân thực
- An toàn sinh học cao (không gây bệnh ở người)
- Phù hợp sản xuất protein dạng phức tạp như VLP

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng gen ORF2 của PCV2 khi được biểu hiện trong hệ Baculovirus có thể tạo ra protein Cap có cấu trúc và tính kháng nguyên tương tự virus tự nhiên. Protein Cap được biểu hiện có khả năng tự lắp ráp thành VLP mà không cần các thành phần virus khác (Lee et al., 2012).
Việc biểu hiện ORF2 trong tế bào Sf9 thường được thực hiện thông qua các vector chuyển gen như pFastBac hoặc pVL1393. Sau khi tạo Baculovirus tái tổ hợp, protein Cap có thể được sản xuất với hàm lượng cao trong tế bào hoặc trong dịch nuôi cấy, tùy thuộc vào thiết kế vector và điều kiện biểu hiện.

Một trong những điểm nổi bật của protein Cap PCV2 là khả năng tự lắp ráp thành VLPs. Đây là các hạt có kích thước và hình thái tương tự virus PCV2 tự nhiên nhưng không chứa vật liệu di truyền. Do đó có tính an toàn cao và không gây nhiễm (Liu et al., 2008).
VLPs đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh, bao gồm cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. Nhờ đặc điểm này, VLPs trở thành nền tảng quan trọng trong nghiên cứu và phát triển vắc xin thế hệ mới.

Để tăng hiệu quả biểu hiện ORF2 trong hệ Baculovirus, nhiều chiến lược tối ưu đã được áp dụng. Trong đó, 
Tối ưu hóa codon phù hợp với tế bào côn trùng
Loại bỏ hoặc điều chỉnh các tín hiệu nội bào không cần thiết
Sử dụng promoter mạnh (polyhedrin)
Điều chỉnh điều kiện nuôi cấy (MOI, thời gian thu hoạch)

Protein Cap và VLPs từ ORF2 biểu hiện bằng baculovirus đã được ứng dụng rộng rãi trong phát triển vắc xin PCV2. Các vắc xin này thuộc nhóm vắc xin tiểu đơn vị, có nhiều ưu điểm so với vắc xin truyền thống:
- An toàn cao, không chứa virus sống
- Khả năng sinh miễn dịch mạnh
- Có thể sản xuất quy mô lớn
- Dễ dàng cải tiến theo biến chủng mới
- Một số vắc xin thương mại hiện nay đã sử dụng công nghệ này, chứng minh tính hiệu quả và tiềm năng ứng dụng thực tiễn

Thiết kế và tạo vector tái tổ hợp 
Gen ORF2 được tổng hợp hoặc khuếch đại bằng PCR, sau đó gắn vào vector chuyển gen như pFastBac1 hoặc pFastBac Dual dưới sự kiểm soát của promoter polyhedrin. Việc gắn gen có thể thực hiện bằng enzyme cắt giới hạn hoặc phương pháp lắp ráp Gibson.
Plasmid tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào E. coli DH5α để nhân dòng và kiểm tra bằng PCR và giải trình tự nhằm xác nhận tính chính xác của trình tự chèn.
Tạo Bacmid tái tổ hợp
Plasmid chứa gen mục tiêu được biến nạp vào dòng E. coli DH10Bac. Tại đây, quá trình tái tổ hợp giữa vector và Bacmid xảy ra thông qua vị trí Tn7. Các khuẩn lạc trắng được chọn lọc nhờ hệ thống sàng lọc xanh – trắng.
Sau đó, Bacmid tái tổ hợp được tách chiết và kiểm tra sự chèn gen bằng PCR đặc hiệu.
Chuyển nạp Bacmid vào tế bào côn trùng
Bacmid DNA được trộn với tác nhân chuyển nạp, chẳng hạn Cellfectin, rồi đưa vào tế bào côn trùng Sf9. Sau khi xâm nhập vào tế bào, Bacmid đóng vai trò như bộ gen virus hoàn chỉnh, bắt đầu quá trình sao chép và tạo ra các hạt Baculovirus tái tổ hợp thế hệ P1.
Khuếch đại Baculovirus 
Virus P1 được thu nhận và sử dụng để nhiễm vào các tế bào Sf9 mới nhằm tạo ra các thế hệ virus có hiệu giá cao hơn như P2 và P3. Hiệu giá virus có thể được xác định bằng phương pháp TCID₅₀  hoặc plaque assay.
Biểu hiện Protein Cap tái tổ hợp 
Tế bào Sf9 được nhiễm Baculovirus tái tổ hợp với hệ số nhiễm MOI thích hợp, thường từ 1 đến 5. Sau thời gian 48 đến 96 giờ, protein Cap tái tổ hợp được biểu hiện mạnh trong tế bào hoặc được tiết ra môi trường nuôi cấy, tùy thuộc vào thiết kế vector.
Thu nhận và phân tích Protein 
Tế bào được thu nhận và ly giải để giải phóng protein. Protein tái tổ hợp có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực, ví dụ Ni-NTA nếu protein có gắn His-tag. Sau đó, protein được phân tích bằng các kỹ thuật như SDS-PAGE, Western blot và ELISA nhằm đánh giá kích thước, độ tinh sạch và tính kháng nguyên.

Hệ thống biểu hiện Baculovirus là một nền tảng hiệu quả và an toàn để sản xuất protein tái tổ hợp, đặc biệt là protein Cap của PCV2 từ gen ORF2. Nhờ khả năng tạo VLPs và kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh, hệ thống này trở thành một trong những lựa chọn quan trọng trong phát triển vắc xin tiểu đơn vị phòng PCV2 trên lợn.
Trong tương lai, việc tối ưu hóa quy trình sản xuất, cải thiện hiệu suất biểu hiện và mở rộng quy mô sẽ góp phần nâng cao khả năng ứng dụng thực tiễn của công nghệ này. Đây là hướng tiếp cận có giá trị, đặc biệt đối với các quốc gia đang phát triển như Việt Nam, nơi nhu cầu kiểm soát bệnh truyền nhiễm trên đàn lợn ngày càng cấp thiết.

Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet). 

Tài liệu tham khảo
- Cao, W., Cao, H., Yi, X., et al. (2019). Development of a high-yield process for PCV2 VLP vaccine. AMB Express, 9, 164.
- Chen, Y. Y., Yang, W. C., Chang, Y. K., et al. (2020). Construction of baculovirus vectors expressing PCV2 Cap protein. Veterinary Research, 51, 112.
- Lekcharoensuk, P., Morozov, I., Paul, P. S., et al. (2004). Epitope mapping of PCV2 capsid protein. Journal of Virology, 78(15), 8135–8145.
- Lee, J., Bae, S., Kim, H., et al. (2012). Efficient production of PCV2 capsid protein using baculovirus. International Journal of Industrial Entomology, 24(1), 23–27.
- Liu, L. J., Suzuki, T., Tsunemitsu, H., et al. (2008). Efficient production of PCV2 virus-like particles using baculovirus. Archives of Virology, 153, 2291–2295.
- Ye, Y., Cheng, X., Zhang, J., et al. (2013). Baculovirus-based expression of PCV2 Cap protein induces immune response. Virology Journal, 10, 316.
- Zhang, X., et al. (2016). Regulation of PCV2 VLP expression in baculovirus system. Bioresources and Bioprocessing, 3, 37.
Câu hỏi thường gặp:
1. PCV2 là gì?
PCV2, hay Porcine circovirus type 2, là virus gây bệnh quan trọng trên lợn, liên quan đến hội chứng suy giảm đa hệ thống sau cai sữa và nhiều rối loạn miễn dịch khác. Đây là một trong những tác nhân ảnh hưởng lớn đến sức khỏe đàn lợn và hiệu quả chăn nuôi.
2. Gen ORF2 của PCV2 có vai trò gì?
Gen ORF2 mã hóa protein Cap, là protein cấu trúc chính của virus PCV2. Protein này chứa các epitope kháng nguyên quan trọng và có khả năng tự lắp ráp thành VLPs, vì vậy ORF2 được xem là mục tiêu chính trong nghiên cứu phát triển vắc xin PCV2.
3. Hệ thống biểu hiện Baculovirus là gì?
Hệ thống biểu hiện Baculovirus là nền tảng công nghệ sinh học sử dụng Baculovirus để đưa gen mục tiêu vào tế bào côn trùng, từ đó biểu hiện protein tái tổ hợp. Hệ thống này thường được ứng dụng trong sản xuất protein, vắc xin tiểu đơn vị và các cấu trúc giống virus.
4. Vì sao Baculovirus phù hợp để sản xuất protein Cap tái tổ hợp?
Baculovirus có khả năng biểu hiện protein ở mức cao trong tế bào côn trùng, đồng thời hỗ trợ quá trình gấp cuộn và biến đổi hậu dịch mã gần với tế bào nhân chuẩn. Nhờ đó, protein Cap tái tổ hợp có thể giữ được cấu trúc và tính kháng nguyên gần giống protein tự nhiên.
5. VLPs trong nghiên cứu vắc xin PCV2 có ý nghĩa gì?
VLPs là các hạt giống virus được hình thành từ protein Cap nhưng không chứa vật liệu di truyền của virus. Vì không có khả năng gây nhiễm nhưng vẫn mô phỏng được cấu trúc kháng nguyên, VLPs có thể kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh và là nền tảng quan trọng trong phát triển vắc xin PCV2 thế hệ mới.
Xem thêm:
- TẠI SAO VI KHUẨN HAEMOPHILUS PARAGALLINARUM CÔNG CƯỜNG ĐỘC LẠI KHÔNG CÓ DẤU HIỆU BỆNH TRÊN GÀ?
- NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHẬN DIỆN SỚM SỰ CỐ KỸ THUẬT (Phần I)
- NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHẬN DIỆN SỚM SỰ CỐ KỸ THUẬT (Phần II)