Chứng nội tại trong PCR, còn gọi là
Internal Control – IC, là một trình tự DNA hoặc RNA được đưa vào mẫu hoặc phản ứng PCR để theo dõi quá trình xét nghiệm, từ tách chiết acid nucleic đến khuếch đại và ghi nhận tín hiệu.
IC không phải là tác nhân gây bệnh cần phát hiện mà đóng vai trò như một “
tín hiệu kiểm soát”, giúp xác nhận mẫu đã được xử lý đúng, phản ứng PCR hoạt động bình thường và kết quả thu được có đủ độ tin cậy.
Trong trường hợp DNA hoặc RNA của tác nhân không được phát hiện nhưng IC vẫn khuếch đại đúng yêu cầu, kết quả âm tính có thể được xem là hợp lệ. Ngược lại, nếu cả tác nhân mục tiêu và IC đều không khuếch đại, cần nghi ngờ quá trình xét nghiệm đã gặp sự cố và chưa thể kết luận mẫu âm tính.
Vì vậy, việc kiểm soát chứng nội tại là một trong những yếu tố quan trọng giúp nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của kết quả xét nghiệm. Tại
Fivevet, chất lượng được kiểm soát chặt chẽ trong từng bước phân tích, góp phần bảo đảm kết quả có giá trị trong công tác chẩn đoán và giám sát dịch bệnh.
I. Vì sao kết quả PCR âm tính chưa chắc là âm tính thực sự?
Một kết quả PCR âm tính chưa chắc đồng nghĩa với việc mẫu bệnh phẩm không chứa tác nhân gây bệnh. Đây là thực tế có thể gặp trong các phòng xét nghiệm sinh học phân tử.
Mẫu huyết thanh xét nghiệm virus ASFV, PRRSV hoặc SARS-CoV-2 có thể cho kết quả âm tính do:
- Quá trình tách chiết DNA/RNA thất bại.
- Acid nucleic bị phân hủy trong quá trình bảo quản.
- Trong mẫu chứa chất ức chế enzyme PCR như hemoglobin, heparin, polysaccharide hoặc hợp chất phenol.
- Sai sót khi chuẩn bị phản ứng PCR.
Khi đó, máy PCR vẫn có thể báo “Negative” dù phản ứng không hoạt động đúng. Vì vậy, chứng nội tại (Internal Control – IC) được đưa vào quy trình để theo dõi chất lượng phân tích và đánh giá độ tin cậy của kết quả.
II. Chứng nội tại hoạt động như thế nào?
Có thể hình dung IC giống mã theo dõi của một kiện hàng. Nếu cả kiện hàng và mã theo dõi đều “mất tích”, nhiều khả năng quá trình vận chuyển đã xảy ra lỗi.
Trong PCR, IC cũng “đi cùng” mẫu bệnh phẩm. Tín hiệu IC cho biết quá trình tách chiết và khuếch đại có hoạt động đúng hay không, từ đó giúp phân biệt mẫu âm tính với trường hợp phản ứng thất bại.
Nhờ có IC, phòng xét nghiệm có thể phát hiện những bất thường liên quan đến chất lượng mẫu, quá trình tách chiết, sự phân hủy acid nucleic hoặc các yếu tố gây ức chế phản ứng PCR trước khi đưa ra kết luận cuối cùng.
III. Có những loại chứng nội tại nào?
Tùy mục đích sử dụng và thiết kế của bộ xét nghiệm, chứng nội tại thường được chia thành bốn dạng chính.
1. Chứng nội tại là gene của vật chủ
Loại IC này tận dụng một gene luôn tồn tại trong tế bào của mẫu bệnh phẩm.
Ví dụ:
- Gene GAPDH hoặc ACTB (β-actin) trong mẫu máu người.
- Gene RPP30 trong nhiều bộ kit chẩn đoán SARS-CoV-2.
- Gene 18S rRNA trong các xét nghiệm sinh học phân tử trên động vật.
Nếu các gene này khuếch đại thành công, có thể xác nhận
- Mẫu chứa đủ tế bào.
- Quá trình tách chiết acid nucleic đạt yêu cầu.
- Phản ứng PCR không bị ức chế nghiêm trọng.
Do sử dụng cặp mồi riêng, loại IC này không phản ánh trực tiếp hiệu quả khuếch đại của mục tiêu xét nghiệm.
2. Chứng nội tại được tạo từ chính trình tự đích
Ở dạng này, một đoạn DNA tổng hợp gần giống DNA đích được tạo ra và chỉnh sửa để có thể phân biệt trong quá trình phân tích.
Đoạn DNA tổng hợp có thể được chèn thêm khoảng 30–50 bp hoặc thay đổi vùng nhận biết của probe. Vì sử dụng cùng cặp mồi với DNA đích, IC và mục tiêu xét nghiệm sẽ cạnh tranh trong cùng một phản ứng PCR.
Dạng chứng nội tại này đặc biệt hữu ích khi cần đánh giá hiệu suất khuếch đại của hệ thống.
3. Chứng nội tại có nguồn gốc khác nhưng dùng cùng cặp mồi
Trong trường hợp này, phần thân DNA của chứng nội tại không liên quan đến tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên, hai đầu của phân tử được gắn thêm các trình tự nhận biết tương ứng với cặp mồi PCR.
Nhờ đó, IC vẫn được khuếch đại bằng cặp mồi của DNA đích nhưng có thể phân biệt với sản phẩm đích dựa trên kích thước hoặc đầu dò đặc hiệu.
Thiết kế này thường được sử dụng khi không muốn tạo một bản sao biến đổi từ chính DNA đích.
4. Chứng nội tại là một hệ thống độc lập
Đây là dạng IC phổ biến trong các bộ kit multiplex Real-time PCR. Hệ thống gồm:
- Một trình tự DNA hoặc RNA riêng.
- Một cặp mồi riêng.
- Một đầu dò riêng.
Trong nhiều bộ kit Real-time PCR phát hiện virus thú y, tín hiệu FAM được sử dụng để phát hiện mục tiêu xét nghiệm, trong khi tín hiệu HEX hoặc VIC được dùng để theo dõi chứng nội tại.
Nhờ sử dụng các kênh tín hiệu khác nhau, hệ thống có thể đồng thời phát hiện tác nhân gây bệnh và kiểm tra tình trạng hoạt động của phản ứng trong cùng một lần chạy.
IV. Chứng nội tại giúp kiểm soát những công đoạn nào?
Tùy thời điểm được bổ sung vào quy trình xét nghiệm, IC có thể giúp kiểm soát nhiều công đoạn khác nhau.
- Nếu được bổ sung trước bước tách chiết, IC sẽ đánh giá toàn bộ quá trình từ tách chiết acid nucleic đến khuếch đại PCR.
- Nếu được bổ sung sau bước tách chiết, IC chủ yếu phản ánh chất lượng phản ứng PCR và khả năng xuất hiện các chất ức chế.
Ngoài ra, khi được thiết kế sử dụng cùng cặp mồi với DNA đích, IC còn giúp đánh giá hiệu suất khuếch đại của hệ thống và phát hiện các trường hợp giảm độ nhạy của phản ứng.
V. Chứng nội tại – yếu tố bảo đảm độ tin cậy của kết quả PCR
Chứng nội tại không phải tác nhân cần phát hiện mà là “người giám sát thầm lặng” của toàn bộ quy trình PCR. IC giúp phòng xét nghiệm phân biệt âm tính thật với âm tính giả, đồng thời phát hiện sớm lỗi trong quá trình tách chiết, khuếch đại hoặc các yếu tố gây ức chế phản ứng.
Trong các hệ thống PCR và Real-time PCR hiện đại, sử dụng chứng nội tại gần như đã trở thành yêu cầu quan trọng để bảo đảm độ tin cậy của kết quả xét nghiệm. Tuy nhiên, IC cần được bổ sung đúng thời điểm và diễn giải theo hướng dẫn của từng bộ kit cũng như quy trình kiểm soát chất lượng của phòng xét nghiệm.
Kết quả điện di PCR với chứng nội tại, mẫu dương tính, chứng dương và chứng âm
Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet).
Câu hỏi thường gặp:
1. Chứng nội tại có phải là chứng dương không?
Không. IC được sử dụng để theo dõi quy trình tách chiết và khuếch đại, còn chứng dương xác nhận hệ thống có khả năng phát hiện đúng mục tiêu xét nghiệm.
2. Mẫu âm tính nhưng IC dương tính có đáng tin cậy không?
Thông thường, đây là kết quả âm tính hợp lệ vì tín hiệu IC cho thấy quy trình xét nghiệm đã hoạt động đúng.
3. Cả mục tiêu và IC đều âm tính có thể kết luận mẫu âm tính không?
Không nên. Trường hợp này thường được xem là kết quả không hợp lệ do có thể xảy ra lỗi tách chiết, phản ứng bị ức chế, acid nucleic bị phân hủy hoặc sai sót kỹ thuật.
4. IC nên được thêm trước hay sau bước tách chiết?
Thêm IC trước bước tách chiết giúp kiểm soát toàn bộ quy trình. Thêm sau bước tách chiết chủ yếu giúp theo dõi phản ứng khuếch đại và sự hiện diện của chất ức chế.
5. Vì sao Real-time PCR sử dụng FAM cho mục tiêu và HEX hoặc VIC cho IC?
Các kênh huỳnh quang khác nhau giúp phân biệt tín hiệu của mục tiêu xét nghiệm với tín hiệu chứng nội tại trong cùng một phản ứng multiplex.
Xem thêm:
-
Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus
-
Hướng dẫn các bước phân lập virus cúm từ mẫu bệnh phẩm trên hệ thống trứng gà có phôi
-
Tại sao vi khuẩn haemophilus paragallinarum công cường độc lại không có dấu hiệu bệnh trên gà?
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
