Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition – HI) là kỹ thuật xét nghiệm giúp phát hiện và định lượng kháng thể chống lại các vi rút có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, được ứng dụng rộng rãi trong thú y. Nhờ độ chính xác cao và khả năng áp dụng linh hoạt, phản ứng HI trở thành công cụ quan trọng trong chẩn đoán nhiều bệnh truyền nhiễm. Trong đó, ở lợn
Porcine Parvovirus (PPV) là nguyên nhân hàng đầu gây chết thai, sảy thai, làm giảm năng suất sinh sản và gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Cùng
Fivevet tìm hiểu ứng dụng của phản ứng HI trong phát hiện kháng thể
PPV, góp phần bảo vệ đàn lợn và nâng cao hiệu quả chăn nuôi.
Phát hiện kháng thể vi rút PPV bằng phản ứng HI
1. Sơ lược về bệnh PPV
Porcine Parvovirus (PPV) hay còn gọi là bệnh thai gỗ, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm và phổ biến trong chăn nuôi lợn, đặc biệt gây thiệt hại nghiêm trọng đến khả năng sinh sản của lợn nái. Bệnh do Parvovirus ở lợn có thể lây lan qua đường tiêu hóa, hô hấp và sinh sản, đồng thời rất khó kiểm soát do đặc tính bền vững ngoài môi trường.
2. Phản ứng HI là gì?
Phản ứng HI (Hemagglutination Inhibition) là phương pháp xét nghiệm dựa trên cơ chế ức chế sự kết dính của hồng cầu. PPV có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, nhưng khi trong huyết thanh đã có kháng thể chống PPV, hiện tượng này sẽ không xảy ra. Nhờ vậy, phản ứng HI được dùng để phát hiện kháng thể kháng PPV, giúp chẩn đoán bệnh chính xác và kiểm tra mức độ miễn dịch của đàn lợn.
3. Tầm quan trọng của việc tầm soát kháng thể
Phản ứng HI không chỉ giúp đánh giá hiệu quả tiêm phòng vắc xin PPV mà còn hỗ trợ phát hiện sớm những đàn lơn có miễn dịch yếu. Nhờ đó, người chăn nuôi có thể quản lý tốt đàn nái sinh sản, hạn chế tối đa tình trạng sảy thai hàng loạt và giảm thiểu thiệt hại kinh tế trong chăn nuôi.
4. Nguyên lý phản ứng HI
PPV có khả năng gây kết dính hồng cầu, nhưng nếu trong huyết thanh có kháng thể thì vi rút sẽ bị trung hòa và không còn khả năng kết dính. Khi tiến hành xét nghiệm, người ta so sánh mẫu thử với mẫu đối chứng để xác định sự khác biệt. Hiệu giá kháng thể được tính dựa trên mức pha loãng cao nhất của huyết thanh mà vẫn còn khả năng ức chế ngưng kết.
Sơ đồ nguyên lý phản ứng HI phát hiện PPV
5. Vật liệu và hóa chất
Để thực hiện phản ứng HI phát hiện kháng thể PPV ở lợn, cần chuẩn bị các vật liệu gồm:
- Huyết thanh lợn đã bất hoạt.
- Vi rút PPV chuẩn (4 HA đơn vị).
- Hồng cầu 1%.
- PBS, khay vi thể 96 giếng, micropipette.
- Đĩa đọc kết quả đáy tròn.
6. Quy trình thực hiện phản ứng HI
6.1. Xử lý mẫu xét nghiệm
- Mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể: máu được lấy vô trùng, lượng tối thiểu là 1 ml, để đông, chắt lấy huyết thanh. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C - 8°C
- Mẫu máu sau khi đông li tâm lạnh ở 4000 vòng/phút trong 10 phút thu huyết thanh.
- Huyết thanh sau khi được xử lý bất hoạt ở 56°C trong 30 phút, xử lý kháng sinh trong 60 phút.
Chú ý: Khi xét nghiệm kháng thể với một số mẫu có một số yếu tố gây dương tính giả hoặc không đọc được kết quả, trước khi tiến hành thí nghiệm cần xử lý mẫu huyết thanh để loại bỏ yếu tố gây dương tính giả bằng cách sau:
* Xử lý với Kaoline:
- Nhỏ huyết thanh vào Kaoline tỷ lệ 1:1.
- Lắc đều trong vòng 30p ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 4000 vòng 10p, thu phần nước trong phía trên.
* Hấp phụ huyết thanh cần chẩn đoán với hồng cầu chuột Lang:
- Nhỏ huyết thanh vào hồng cầu 20% tỷ lệ 1:1.
- Lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 2 - 5 phút.
- Thu lấy huyết thanh đã hấp phụ để xét nghiệm.
6.2. Phản ứng ngưng kết hồng cầu chuột Lang (HA: Haemagglutination test)
- Cho 50 microlit PBS 1X vào mỗi giếng từ giếng 1 đến giếng 12.
- Cho 50 microlit huyết thanh cần kiểm tra vào giếng 1.
- Pha loãng huyết thanh:
+ Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 1.
+ Hút 50 microlit từ giếng 1 chuyển sang giếng 2, trộn đều.
+ Tiếp tục hút 50 microlit từ giếng 2 sang giếng 3, lặp lại đến giếng 11.
+ Ở giếng 11, trộn đều và hút bỏ 50 microlit.
- Cho kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ số 1 đến số 11, mỗi giếng 50 microlit. Giếng 12 cho thêm 50 microlit PBS.
- Lắc nhẹ đĩa, đặt ở nhiệt độ 4°C trong 60 phút.
- Thêm 50 microlit hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, lắc nhẹ.
- Tiếp tục ủ đĩa phản ứng ở 4°C trong 60 phút.
- Đọc kết quả phản ứng.
- Trình tự tiến hành phản ứng:
Sơ đồ quy trình thực hiện phản ứng HA
6.3 Pha và chuẩn độ kháng nguyên 4HA
Pha 4 HAU
- Ví dụ: Nếu hiệu giá kháng nguyên trong phản ứng HA là 1/256, thì 4 HAU= (1/256) × 4 = 1/64.
- Để pha 4 HAU: Trộn 1 phần kháng nguyên với 63 phần PBS 1X, sau đó lắc đều.
Kiểm tra lại 4 HAU
- Cho vào các giếng C2–C6 và D2–D6: 50 microlit PBS 1X.
- Thêm 100 microlit kháng nguyên 4 HAU vào giếng C1 và D1, trộn đều.
- Hút 50 microlit từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều 15–20 lần.
- Tiếp tục hút 50 microlit từ giếng 2 sang giếng 3, lặp lại đến giếng 5, sau đó hút bỏ 50 microlit.
- Giếng số 6 làm đối chứng hồng cầu.
- Thêm 50 microlit hồng cầu 1% vào tất cả các giếng.
- Lắc nhẹ đĩa và đọc kết quả sau 20 phút.
Cách đánh giá kết quả
- Nếu ngưng kết đến giếng thứ 3 → kháng nguyên pha đạt.
- Nếu ngưng kết đến giếng thứ 4 (hoặc hơn) → kháng nguyên pha đặc → bổ sung thêm PBS bằng lượng PBS ban đầu dùng để pha 4 HAU.
- Nếu ngưng kết chỉ đến giếng thứ 2 → kháng nguyên pha loãng → bổ sung thêm kháng nguyên bằng lượng kháng nguyên ban đầu dùng để pha 4 HAU.
Dựa trên kết quả, điều chỉnh lượng kháng nguyên hoặc PBS để thu được dung dịch kháng nguyên 4 HAU chuẩn.
6.4 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination Inhibition test)
- Cho 50 microlit PBS 1X vào mỗi giếng từ số 1 đến số 12.
- Thêm 50 microlit huyết thanh cần kiểm tra vào giếng số 1.
- Pha loãng huyết thanh:
+ Trộn đều huyết thanh với PBS ở giếng 1.
+ Hút 50 microlit từ giếng 1 sang giếng 2, trộn đều.
+ Tiếp tục hút 50 microlit từ giếng 2 sang giếng 3,… làm tương tự đến giếng 11.
+ Ở giếng 11, hút bỏ 50 microlit.
- Thêm 50 microlit kháng nguyên 4 đơn vị HA vào các giếng từ 1 → 11.
- Ở giếng 12, thêm 50 microlit PBS (đối chứng).
- Lắc nhẹ, ủ ở 4°C trong 60 phút.
- Thêm 50 microlit hồng cầu 1% vào tất cả các giếng, lắc nhẹ.
Đặt đĩa phản ứng ở 4°C, sau 60 phút đọc kết quả.
- Trình tự tiến hành phản ứng:
Sơ đồ quy trình thực hiện phản ứng HI
6.5 Đọc kết quả sau 60 phút
- Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng.
- Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.
- Phản ứng âm tính: Xuất hiện các hạt ngưng kết lấm tấm. Chứng tỏ không có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể trong phản ứng
6.6 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp
Độ chụm
Độ đúng
Độ nhạy và độ đặc hiệu
7. Biện pháp phòng bệnh PPV ở lợn
- Tiêm phòng vắc xin định kỳ cho nái.
- Theo dõi huyết thanh học thường xuyên trong đàn.
- Vệ sinh, sát trùng chuồng trại định kỳ.
- Cách ly đàn hậu bị mới nhập trước khi phối giống.
- Xử lý đúng cách thai chết, nhau thai để tránh lây lan mầm bệnh.
8. Kết luận
Ý nghĩa của phản ứng HI trong chẩn đoán PPV:
- Phát hiện kháng thể PPV nhanh chóng và hiệu quả.
- Giúp giám sát miễn dịch đàn, kiểm tra hiệu quả tiêm phòng vắc-xin.
- Yêu cầu thao tác chính xác, đọc kết quả đúng để tránh sai lệch.
Câu hỏi thường gặp:
1. Phản ứng HI là gì?
Phản ứng HI (Hemagglutination Inhibition) là kỹ thuật xét nghiệm dựa trên nguyên lý ức chế sự kết dính hồng cầu.
2. Nguyên lý của phản ứng HI như thế nào?
Kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh sẽ ức chế hiện tượng ngưng kết hồng cầu do kháng nguyên PPV gây ra. Nếu có kháng thể, hồng cầu sẽ lắng xuống đáy giếng.
3. Phản ứng HI có ưu điểm gì so với các phương pháp khác?
Phản ứng HI có độ chính xác cao, dễ triển khai trong phòng thí nghiệm thú y.
4. Phản ứng HI có áp dụng cho nghiên cứu dịch tễ học PPV không?
Có. Phản ứng HI là công cụ quan trọng để giám sát sự lưu hành của PPV trong các trại chăn nuôi và vùng dịch tễ.
5. Kết quả HI âm tính có khẳng định đàn hoàn toàn không nhiễm PPV không?
Không hẳn. HI âm tính có thể do lợn chưa tiếp xúc với PPV, nhưng cũng có thể do nồng độ kháng thể thấp dưới ngưỡng phát hiện. Do đó, cần kết hợp nhiều lần xét nghiệm hoặc phương pháp khác như PCR để loại trừ hoàn toàn khả năng nhiễm.
Xem thêm:
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
