Hội chứng còi cọc trên lợn (PCV2) là một bệnh truyền nhiễm, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới. Việc phát triển các phương pháp phòng ngừa hiệu quả, đặc biệt là vắc xin, là yếu tố then chốt trong việc kiểm soát bệnh này. Công nghệ DNA tái tổ hợp đã mở ra những cơ hội mới trong việc sản xuất vắc xin PCV2, giúp tăng cường hiệu quả bảo vệ lợn khỏi hội chứng còi cọc và góp phần nâng cao năng suất chăn nuôi. Cùng Fivevet tìm hiểu về ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vắc xin PCV2 ở bài viết này.
I. Tổng quan về PCV2 và vắc xin thế hệ mới phòng bệnh hiện nay
Vi rút PCV2 (Porcine Circo Virus 2) gây ra các rối loạn lâm sàng khác nhau và được gọi là bệnh liên quan đến Circovirus ở heo (PCVADs). PCVAD bao gồm hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (PMWS), bệnh hô hấp phức hợp ở heo (PRDC), hội chứng viêm da và thận ở heo (PDNS), rối loạn sinh sản, tăng sinh và hoại tử viêm phổi (PNP), run bẩm sinh loại II (CT) và viêm ruột.
PCV2 có khả năng biến đổi nhanh chóng nhờ vào khả năng tái tổ hợp và sự xuất hiện của nhiều biến thể theo thời gian. Đến nay, PCV2 đã được phân loại thành 8 kiểu gen: PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d, PCV2e, PCV2g, PCV2h. Kiểu gen PCV2a chủ yếu xuất hiện từ năm 1996 đến đầu những năm 2000. Từ năm 2006, kiểu gen PCV2b bắt đầu trở thành chủ yếu. Tiếp đó, một biến thể di truyền từ PCV2b là PCV2d xuất hiện từ năm 2012 đến 2016 và nhanh chóng chiếm ưu thế trên toàn cầu. Hiện nay, 03 kiểu gen PCV2a, PCV2b và PCV2d là những kiểu gen phổ biến nhất trên thế giới.
1. Cấu trúc gene của vi rút PCV2
PCV2 mang một chuỗi ADN sợi đơn và bao gồm 11 khung đọc mở (ORF - open reading frame). Trong đó, ORF1 đến ORF6 đã được xác định là mã hóa các protein liên quan đến quá trình nhân lên, cấu trúc, sinh bệnh, sự tồn tại của vi rút trong tế bào và tương tác miễn dịch giữa vi rút và vật chủ. ORF1 mã hóa protein cần thiết cho việc nhân lên của ADN-PCV trong tế bào chủ.
ORF2, còn được gọi là gen Cap, mã hóa một protein có vai trò quan trọng trong việc kích thích phản ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào đối với PCV2, đồng thời hỗ trợ vi rút trong việc bám dính và xâm nhập vào tế bào của ký chủ. Sự biến đổi di truyền xảy ra ở protein Cap có thể có ảnh hưởng rất lớn đến độc lực của PCV2 in vivo cũng như khả năng nhân lên của vi rút in vitro. Vì thế, hầu hết các nghiên cứu về PCV2 như chẩn đoán, phân tích di truyền, miễn dịch và vắc xin đều tập trung vào ORF2 và protein Cap.
2. Các vắc xin thế hệ mới của PCV2
2.1 Vắc xin tái tổ hợp thể ghép PCV1-2
Vắc xin PCV1-2 tái tổ hợp thể ghép (trên khung bộ gen của PCV1, thay thế ORF2 của PCV1 bằng ORF2 của PCV2) tạo ra đáp ứng kháng thể với protein capsid của PCV2. Vi rút tái tổ hợp thể ghép này có khả năng kích thích sinh miễn dịch bảo hộ chống lại PCV2 trên lợn khi công cường độc. Vắc xin tái tổ hợp thể ghép vô hoạt đã được thương mại hóa Suvaxyn PCV2® One doseTM (Fort Dodge). Năm 2008, vắc xin này tạm thời cấm sử dụng vì phát hiện sự hiện diện của vi rút tái tổ hợp thể ghép PCV1-2a trong thực địa, do vi rút vắc xin không được vô hoạt hoàn toàn. Năm 2011, vắc xin tái tổ hợp thể ghép PCV1-2a phiên bản mới trở lại thị trường, đã được kiểm chứng tính an toàn và hiệu quả trên lợn con.
2.2 Vắc xin tái tổ hợp biểu hiện protein Cap của PCV2
Công nghệ ADN tái tổ hợp cho phép sản xuất một lượng lớn protein của vi rút và được ứng dụng trong nghiên cứu cũng như sản xuất vắc xin tiểu phần phòng bệnh do vi rút. Protein capsid của PCV2 là protein cấu trúc duy nhất của vi rút, có khả năng kích thích sinh miễn dịch. Đến nay, có khá nhiều công trình nghiên cứu về vắc xin tiểu phần phòng bệnh PCV2 được thử nghiệm trên chuột và cả trên lợn, một số đã được thương mại hóa như:
a, Vắc xin tái tổ hợp biểu hiện protein Cap PCV2 trên baculovirus
Vắc xin tiểu phần PCV2 đầu tiên được nghiên cứu trên lợn là vắc xin biểu hiện ORF2 của PCV2 qua baculovirus. Nghiên cứu đã chứng minh rằng protein capsid của PCV2 có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, từ đó giúp bảo vệ lợn khỏi vi rút PCV2 thông qua cơ chế công cường độc. Ngoài ra, tiêm vắc xin protein capsid của PCV2 được biểu hiện qua baculovirus có thể gây đáp ứng miễn dịch dịch thể cũng như miễn dịch qua trung gian tế bào trên lợn. Có bốn loại vắc xin tiểu phần dựa trên ORF2 của PCV2a biểu hiện qua baculovirus đã được thương mại hóa trên toàn thế giới đó là Ingelvac® CircoFLEXTM (Boehringer Ingelheim), Porcilis® PCV, CircumventTM PCV và Circumvent G2 PCV (MSD/Merck Animal Health).
b, Vắc xin tái tổ hợp biểu hiện protein Cap PCV2 trên các loại vi rút, vi khuẩn, nấm men
Vắc xin biểu hiện protein capsid của PCV2 thông qua adenovirus, vi rút giả dại, vi rút đậu lợn, porcine parvovirus, vi khuẩn Bordetella bronchoseptica aroA, vi khuẩn Escherichia coli và thực khuẩn thể lamda (bacteriophage lambda). Các thí nghiệm thực hiện trên chuột và lợn đều chỉ ra rằng các vắc xin tiểu phần chứa protein Cap của PCV2 có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch đặc hiệu với PCV2, đồng thời có thể bảo vệ lợn khỏi PCV2 sau khi thực hiện thử nghiệm cường độc.
Một số vắc xin biểu hiện Protein Cap vào Lactococcus lactis, nấm men qua đường uống cũng giúp tạo được kháng thể đặc hiệu chống PCV2 trên chuột thí nghiệm. Kết quả này cho thấy có khả năng tạo vắc xin tiểu phần phòng bệnh PCV2 cấp qua đường uống. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên được thực hiện trên chuột nên cần phải đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các loại vắc xin này trên lợn.
II. Công nghệ DNA tái tổ hợp trong việc sản xuất vắc xin thế hệ mới
Công nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant DNA techonology) là công nghệ tạo ra các phân tử DNA từ 2 hay nhiều nguồn DNA khác nhau, các phân tử DNA được tạo ra mang các đặc tính của các phân tử DNA cấu thành. Toàn bộ quy trình công nghệ DNA tái tổ hợp bao gồm nhiều bước được thể hiện như hình dưới, được duy trì theo trình tự cụ thể để tạo ra sản phẩm mong muốn.
Tác nhân gây bệnh quan tâm sẽ được cắt đoạn gene đích sử dụng enzyme giới hạn cắt tại vị trí nucleotide đã định sẵn. Hiện trên thế giới có một số dòng emzyme giới hạn AliI, BamHI. EcoRI, HIndII, HindIII, NotI, PsltI, Smal, Xmal. Các enzyme giới hạn có vai trò to lớn trong việc kiến tạo DNA tái tổ hợp điển hình ở đây là EcoRI và BamHI.
Đoạn gene đích được chèn vào Plasmid. Plasmid được sử dụng như một phân tử DNA lạ, có khả năng chèn vào tế bào vật chủ và tự sao chép bên trong tế bào vật chủ. Plasmid thường chứa một gen kháng kháng sinh, cho phép vi khuẩn sống sót khi có một loại kháng sinh cụ thể. Plasmid được chia thành các plasmid nhân dòng, điển hình là pUC19, pJET và plasmid biểu hiện như hệ thống pET ở vi khuẩn.
Plasmid được biểu hiện vào trong hệ thống tế bào vật chủ như: hệ thống tế bào động vật, hệ thống nấm men, hệ thống baculovirus và hệ thống vi khuẩn. Các hệ thống này đều có những ưu và nhược điểm riêng.
Protein tái tổ hợp sau khi được nhân sinh khối trên các hệ thống tế bào vật chủ sẽ được kiểm tra bằng các phương pháp như điện di 1 chiều biến tính (SDS-PAGE) và thẩm tách miễn dịch Western blotting.
Tinh sạch protein tái tổ hợp khỏi hỗn hợp các protein bằng các phương pháp thẩm tích và sắc kí như sắc kí ái lực, sắc kí trao đổi ion,…
Sản phẩm sau khi thu được sẽ được phối trộn các bổ trợ và tá dược. Sản phẩm được kiểm tra thông qua các thử nghiệm trên bản động vật.
III. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp khi nghiên cứu vắc xin PCV2
Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có xuất hiện một số sản phẩm vắc xin tái tổ hợp của các hãng từ nước ngoài, bản chất là gene ORF2- PCV2a trên baculovirus như: tên thương mại Ingelvac CircoFLEX của hãng Boehringer Ingelheim Đức, Porcilis PCV Circumvent PCV của MSD Animal Health, PROVAC Circomaster của Komipharm (Hàn Quốc).
Tại Việt Nam, hiện theo thông tin đăng tải, có nghiên cứu của Đặng Việt Hoàng và cộng sự đã tái tổ hợp thành công protein ORF2 của virus PCV2a trên tế bào côn trùng bằng hệ thống biểu hiện baculovirus. Sản phẩm cũng được chứng minh có hiệu quả phòng bệnh PCV2 trong phòng thí nghiệm.
Tuy nhiên, hiện tại theo những nghiên cứu đã công bố tại Việt Nam có xuất hiện chủ yếu PCV2b, d và h. Phòng thí nghiệm công ty Cổ phần Thuốc Thú Y Trung Ương 5 hiện đã phân lập được những chủng PCV2 này trên thực tế. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu biểu hiện protein mã hóa gen ORF2 của PCV2 b, d và h thông qua tế bào vật chủ là vi khuẩn E. coli BL21. Quy trình này được tiến hành theo sơ đồ như hình sau:
(1) Gen ORF2 được chèn vào plasmid thích hợp thông qua điểm cắt của 2 enzyme giới hạn là NcoI và XhoI.
(2) Biến nạp plasmid vào vi khuẩn s. Nuôi cấy E. coli trên LB đặc thu colony. Các colony sau đó được kiểm tra bằng PCR, cắt enzyme giới hạn và giải trình tự plasmid thu được để xác nhận là đã mang gen ORF2.
(3) Vi khuẩn E. coli sau khi đã kiểm tra được nuôi ở quy mô giống nhỏ trong ống falcon 50mL trong môi trường LB.
(4) Giống vi khuẩn E. coli nuôi cấy trong bình tam giác trong môi trường LB.
(5) Giống sản xuất quy mô lớn nhờ hệ thống lên men sinh khối. Phá vỡ tế bào vi khuẩn bằng sóng siêu âm.
(6) Li tâm thu dịch và kiểm tra sự có mặt của protein Cap mong muốn bằng các phương pháp như SDS-PAGE và Western blotting.
(7) Tinh sạch Protein được thu nhận bằng các phương pháp như sắc kí hay thẩm tích.
(8) Phối trộn với chất bổ trợ thích hợp để tạo ra vắc xin.
(9) Thử nghiệm vắc xin trên chuột và lợn đánh giá tính an toàn và miễn dịch.
Xem thêm:
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
