ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ LỞ MỒM LONG MÓNG (FMD) TRÊN TRÂU, BÒ, LỢN,… BẰNG PHƯƠNG PHÁP LP ELISA

1.    Giới thiệu chung về bệnh
Bệnh lở mồm long móng (Foot and mouth disease - FMD) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật móng guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê, cừu và một số động vật hoang dã khác như hươu, nai. Bệnh do apthovirus thuộc họ Picornaviridae gây nên. Có 7 typ huyết thanh (serotyp) gồm: A, O, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1. Mỗi serotyp của vi rút được phân chia thành nhiều subtyp dựa trên sự khác biệt về cấu trúc kháng nguyên và gen. Mặc dù các triệu chứng lâm sàng của bệnh do vi rút gây ra có thể giống nhau, nhưng giữa các serotyp không tồn tại miễn dịch chéo. Bệnh lở mồm long móng thường xuất hiện thành dịch trên nhiều loài động vật móng guốc chẵn, đặc biệt là ở trâu, bò và lợn. Vi rút xâm nhập chủ yếu qua không khí, dù cũng có thể qua các con đường khác.
Bệnh do nhiều typ và tiểu typ của Aphthovirus gây ra, với sự phân bố của các typ huyết thanh khác nhau trên thế giới. Các typ O và A phổ biến ở nhiều khu vực toàn cầu, trong khi các typ SAT1, SAT2, SAT3 chủ yếu được ghi nhận tại một số quốc gia châu Phi. Typ Asia 1 thường gặp ở nhiều nước châu Á. Trong các ổ dịch, động vật có thể nhiễm một hoặc đồng thời nhiều typ huyết thanh khác nhau. Bệnh có tính chất lây lan nhanh, mạnh, rộng đối với động vật mẫn cảm.
Bệnh có thể lây trực tiếp từ động vật mắc bệnh đến động vật mẫn cảm, hay lây gián tiếp qua sản phẩm động vật (thịt, sữa, tinh dịch, da,...), dụng cụ chăn nuôi, vận chuyển gia súc,...
2.    Ý nghĩa của việc kiểm tra kháng thể FMD
a.    Với những trại chưa tiêm phòng vắc xin FMD
Kết quả kháng thể Dương tính động vật chưa tiêm phòng vắc xin, đồng thời có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh FMD được xác định là động vật đang bị mắc bệnh FMD. Vì vậy việc định kỳ kiểm tra kháng thể FMD có ý nghĩa chẩn đoán bệnh.
b.    Với những trại đã tiêm phòng vắc xin FMD
Ngoài mục đích chẩn đoán bệnh, kết quả kháng thể còn có ý nghĩa đánh giá hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng vắc xin FMD.
Việc kiểm tra kháng thể sau khi tiêm phòng vắc xin FMD là cần thiết để đánh giá được đáp ứng miễn dịch sau khi sử dụng vắc xin có tốt hay không, kháng thể có đạt bảo hộ không, độ đồng đều kháng thể trong đàn,… Thông qua đó đánh giá được chất lượng vắc xin sử dụng, kỹ thuật tiêm vắc xin,…
3.    Lấy mẫu
Mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể: máu được lấy vô trùng, lượng tối thiểu là 3 ml, để đông, chắt lấy huyết thanh. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C.
Mẫu sau khi thu thập cần được bảo quản trong điều kiện lạnh, đóng gói cẩn thận để tránh lây lan mầm bệnh, sau đó nhanh chóng chuyển đến phòng xét nghiệm. Việc này giúp đảm bảo kết quả xét nghiệm đạt độ chính xác cao nhất.
4.    Định lượng kháng thể FMD bằng phương pháp LP ELISA
LP ELISA (Liquid phase blocking ELISA): sử dụng bộ kít ELISA phát hiện kháng thể.
Ưu điểm của phương pháp LP Elisa: có thể định lượng được hàm lượng kháng thể và đánh giá được kháng thể có bảo hộ được hay không.
Nhược điểm của phương pháp: yêu cầu kĩ thuật cao, chi phí đầu tư cao.
Các bước tiến hành phản ứng Định lượng kháng thể FMD (Chuẩn độ pha loãng huyết thanh theo bậc 2):

• Bước 1: Pha loãng mẫu trên đĩa

- Chuẩn bị pha loãng 1/16 cho các mẫu đối chứng (đối chứng C⁺⁺, C^+, C^-).
- Tiếp theo, chuẩn bị pha loãng 1/8 cho mỗi mẫu xét nghiệm trong đĩa nhựa hoặc trong tube. (ví dụ lấy 20μl mẫu xét nghiệm cho vào 140μl Buffer A).
- Cho 50μl đệm A vào tất cả các giếng từ cột 3 đến cột 12 trong đĩa polypropylen đáy chữ U. Cho 50μl mẫu đối chứng đã pha loãng vào các giếng tương ứng như trong sơ đồ. Các giếng kháng nguyên đối chứng (Ca) cho vào 50μl Buffer A.
- Cho 50μl mẫu xét nghiệm đã pha loãng 1/8 đến các giếng tương ứng của hàng A hoặc E,  cột 3-12. Trộn đều 100μl trong các giếng này. Đây là thể tích 100μl của mẫu pha loãng 1/16. Sau đó, chuyển 50μl huyết thanh từ hàng A đến hàng B, trộn đều và chuyển đến hàng D và loại bỏ 50μl từ hàng D. Nồng độ pha loãng mẫu lúc này là 1/16 đến 1/128. Tiếp tục cho các mẫu khác thì lặp lại như trên bắt đầu từ hàng E đến hàng H và loại bỏ 50μl từ hàng H. Xem sơ đồ trong Hình 1:

• Bước 2: Thêm kháng nguyên

- Chuẩn bị pha loãng 1/100 kháng nguyên lở mồm long móng type O/A trong Buffer A.
- Thêm 50μl kháng nguyên đã được pha loãng với tỷ lệ 1/100 vào toàn bộ 96 giếng của đĩa polypropylen đáy chữ U. Đây là nồng độ pha loãng mẫu sử dụng trong xét nghiệm, đạt mức từ 1/32 đến 1/256 theo phương pháp chuẩn độ.
- Trộn đều hỗn hợp huyết thanh xét nghiệm và kháng nguyên bằng cách lắc tay hoặc sử dụng máy, sau đó che kín đĩa. Tiến hành ủ trong khoảng nhiệt độ từ 1°C đến 8°C qua đêm.

• Bước 3. Chuyển hỗn hợp kháng nguyên và mẫu xét nghiệm

Đưa đĩa phản ứng (đĩa đã được phủ kháng thể thỏ) và đĩa polypropylen chứa hỗn hợp mẫu xét nghiệm - kháng nguyên về nhiệt độ phòng.
Làm sạch đĩa phủ kháng thể thỏ bằng cách rửa 5 lần với dung dịch PBS 0,002 M, sau đó làm khô đĩa bằng cách vỗ nhẹ lên khăn mềm.
Trộn đều hỗn hợp kháng nguyên - mẫu xét nghiệm, rồi chuyển 50 μl hỗn hợp này vào các giếng của đĩa phản ứng theo sơ đồ xét nghiệm đã bố trí.
Đậy nắp và ủ lắc liên tục ở nhiệt độ 35°C đến 39°C trong 1 giờ.

• Bước 4. Chuẩn bị dung dịch đệm B

Thêm PBST (Phosphate Buffered Saline with Tween 20) 0,01M (Buffer A) vào sữa bột gầy (skim milk) sao cho nồng độ sữa gầy là 5%. Lắc đều và điều chỉnh pH trong khoảng 7,4 ± 0,2 bằng cách sử dụng dung dịch NaOH 0,1M.
Ví dụ: để pha 100ml dung dịch đệm B, hãy cân 5g sữa bột gầy rồi hòa tan vào 100ml dung dịch đệm A.

• Bước 5. Thêm kháng thể phát hiện (Guinea Pig antiserum)

Trước khi kết thúc quá trình ủ conjugate, cần chuẩn bị dung dịch phát hiện màu OPD (Ortho-Phenylendiamine). Dung dịch này phải được bảo quản trong điều kiện tối. Nếu dung dịch chuyển sang màu vàng, cần loại bỏ và không sử dụng.
Chuẩn bị một đĩa sạch (blanking plate), có thể rửa sạch sau khi sử dụng và che kín các giếng chưa dùng để tái sử dụng cho các xét nghiệm sau. Sau khi ủ conjugate trong 1 giờ, lấy đĩa phản ứng ra khỏi tủ ấm và rửa 5 lần bằng dung dịch PBS, pH 7,4 ± 0,2.
Cho 50 μl Guinea pig đã pha loãng 1/100 vào tất cả 96 giếng trên đĩa phản ứng.
Đậy nắp và ủ lắc liên tục ở nhiệt độ từ 35°C đến 39°C trong 1 giờ.

• Bước 6. Thêm conjugate

Trước khi kết thúc giai đoạn ủ Guinea pig, chuẩn bị pha loãng conjugate 1/200 trong đệm B.
Sau 1 giờ ủ guinea pig, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoài và rửa 5 lần với dung dịch nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2.
Cho 50μl dung dịch conjugate đã pha loãng vào tất cả các giếng trên đĩa phản ứng.
Đậy đĩa và ủ lắc liên tục ở nhiệt độ 35°C đến 39°C trong 1 giờ.

• Bước 7. Thêm dung dịch chất phát màu Substrate Chromogen và dung dịch stop

Trước khi kết thúc giai đoạn ủ conjugate, chuẩn bị dung dịch chất phát màu OPD (Ortho-Phenylendiamine). Dung dịch này phải được giữ trong tối và nếu đã chuyển sang màu vàng thì nên loại bỏ.
Chuẩn bị một đĩa sạch (blanking plate). Đĩa này sau khi dùng xong có thể rửa sạch và dán kín những giếng chưa sử dụng cho những lần xét nghiệm kế tiếp.
Sau ủ conjugate trong 1h, lấy đĩa phản ứng từ tủ ấm ra ngoài và rửa 5 lần với dung dịch nước rửa PBS, pH 7,4 ± 0,2.
Chuẩn bị chất phát màu cho một đĩa phản ứng như sau: lấy 30μl của Substrate - H₂O₂ 3% pha trong 6ml dung dịch chất phát màu OPD. Như vậy H₂O₂ 3% sử dụng là 1/200.
Sau khi rửa, đầu tiên cho 50μl của substrate/chromogen vào cột bank của đĩa “blanking plate” và sau đó là tất cả các giếng của đĩa phản ứng, đậy nắp để ở nhiệt độ phòng trong tối. Thời gian được tính bắt đầu từ giếng đầu tiên sau khi cho chất phát màu.
Sau 15 phút ủ substrate/chromogen, đầu tiên cho 50μl dung dịch Stop (axit sulfuric 1,25M) vào cột blank của đĩa “blanking plate”, sau đó là tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Lắc đều bằng máy lắc (hoặc dùng tay vỗ nhẹ vào các thành giếng) để bảo đảm rằng hỗn hợp này đã được trộn đều. Tất cả các giếng lúc này chứa 50μl dung dịch substrate/chromogen và 50μl dung dịch Stop.

• Bước 8. Đọc đĩa phản ứng

Mật độ quang (OD) của từng giếng trong đĩa được đo bằng máy quang phổ.
Trước khi tiến hành đọc đĩa, cần đảm bảo không có bong bóng trong bất kỳ giếng nào để tránh sai số trong phép đo quang học. Đồng thời, kiểm tra kỹ để đảm bảo không có dấu vết (như dấu tay) hoặc hiện tượng ngưng tụ trên thành đĩa phản ứng. Nếu phát hiện bong bóng, dùng đầu tip sạch để loại bỏ.
Lau sạch đáy đĩa bằng khăn mềm. Đầu tiên, đặt đĩa “blanking plate” vào máy đọc để hiệu chỉnh, sau đó mới đặt các đĩa phản ứng tiếp theo. Hãy kiểm tra chắc chắn rằng kính lọc ở bước sóng 492nm đã được thiết lập và các đĩa phản ứng sẵn sàng cho việc đo lường.

• Bước 9. Diễn giải kết quả

Đĩa đọc được phân tích cho hai nhóm:
-       Phân tích các giá trị đối chứng
Giá trị phần trăm giá trị ức chế (percent inhibition) của mẫu đối chứng được dùng để chấp nhận kết quả. Tính phần trăm ức chế của mẫu đối chứng, Pl_R, theo công thức sau: Trong đó:
OD_R là mật độ quang của mẫu đối chứng;
OD_Ca là mật độ quang trung bình của đối chứng kháng nguyên.
Tính phần trăm giá trị ức chế của mẫu xét nghiệm, Pl_s, theo công thức sau: Trong đó:
OD_s là mật độ quang của mẫu xét nghiệm;
OD_Ca là mật độ quang trung bình của đối chứng kháng nguyên.
-       Tính toán và chấp nhận các giá trị đối chứng
Các giá trị OD và PI của đối chứng kháng nguyên và các giá trị PI của ba đối chứng khác (C++, C+ và C-) được sử dụng để chấp nhận hoặc không chấp nhận kết quả khi so với bảng giới hạn bắt buộc của bảng dữ liệu, từ đó đưa ra kết luận chấp nhận cho từng đĩa phản ứng theo Bảng 1.
Bảng 1 - Các đối chứng Ca, C++, C+ và C-
Với sự biến đổi trong giá trị OD và các giá trị Pl của các đối chứng được so sánh với giới hạn trên và giới hạn dưới về tính ổn định của các giá trị đối chứng theo Bảng 2.
Bảng 2 - Giới hạn trên và giới hạn dưới của các giá trị OD và Pl
 

• Giải thích kết quả mẫu huyết thanh xét nghiệm

Ngưỡng đánh giá cho phương pháp này là phần trăm giá trị ức chế 50% (Pl = 50).
- Nếu tất cả giá trị Pl trong 2 giếng của mẫu huyết thanh xét nghiệm nhỏ hơn 50 (Pl<50),>ì mẫu này được xem là không có kháng thể (mẫu âm tính).
- Nếu có một trong 2 giếng đó có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 nhưng tất cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế tiếp có Pl ≤ 50 thì mẫu xét nghiệm này có hiệu giá kháng thể là 1/32.
- Nếu cả hai giếng có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl >50) ở độ pha loãng 1/32 và tất cả các giá trị Pl ở độ pha loãng kế tiếp có Pl ≤ 50 thì mẫu này có hiệu giá kháng thể là 1/45 và mẫu xét nghiệm này được xem là mẫu có kháng thể (mẫu dương tính).
- Hiệu giá kháng thể của các mẫu xét nghiệm có giá trị Pl lớn hơn 50 (Pl > 50) ở độ pha loãng 1/32 có thể tham khảo ở Bảng 3. Nếu hiệu giá kháng thể lớn hơn 90 (> 90) cho biết rằng con vật này có khả năng bảo hộ với serotype vi rút lở mồm long móng tương đồng với kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Bảng 3 - Bảng tính hiệu giá kháng thể ở độ pha loãng bậc 2

• Tham khảo kết quả được thực hiện tại FiveLab

​
Hãy liên hệ FiveLab theo số hotline 0377 499 555 - 0822 120 555 để được tư vấn, lấy mẫu định lượng kháng thể FMD nhanh chóng, kịp thời.

•   FIVELAB là Trung tâm Chẩn đoán Xét nghiệm và Kiểm nghiệm Thú y Trung Ương 5, trực thuộc Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung Ương 5 (FIVEVET).
•  FIVELAB với sứ mệnh "Vì sức khỏe vật nuôi", Fivelab với phương châm: KỊP THỜI - CHÍNH XÁC - TẬN TÂM - BẢO MẬT - TRÁCH NHIỆM mang dịch vụ tốt nhất đến Quý đối tác, khách hàng.
• FiveLab tự hào là một trong số ít đơn vị có:

-          Làm việc 24/7.
-          Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn AN TOÀN SINH HỌC CẤP III, đạt tiêu chuẩn ISO 17025.
Xem thêm:
-          Định lượng kháng thể dịch tả lợn cổ điển bằng phương pháp NPLA
-          Phát hiện và định chủng vi rút PRRS bằng phương pháp PCR, qPCR
Phát hiện virus gây bệnh dịch tả lợn châu phi (ASF) bằng phương pháp PCR/qPCR