BỘ LỌC TÌM KIẾM Click xem bộ lọc
Theo danh mục

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HI (HEMAGGLUTINATION INHIBITION ASSAY) TRONG XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM

Ngày đăng: 26/11/2024

Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà (IB) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút IBV, thuộc họ Coronaviridae gây nên. Đây là một bệnh có khả năng lây truyền cao, chủ yếu qua hai con đường là đường hô hấp hoặc tiếp xúc với phân của con vật mang bệnh. Bệnh IB ảnh hưởng chính đến hệ hô hấp của gà cũng như nhiều loài khác thuộc họ chim như gà tây, gà lôi, ngỗng, bồ câu, vv… Bệnh IB đã sớm được phát hiện từ những năm 1930 và hiện tại đã trở thành một bệnh xuất hiện toàn cầu với rất nhiều biến chủng khác nhau. Bài viết này Fivevet sẽ đưa ra các phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu để xác định kháng thể kháng vi rút viêm phế quản truyền nhiễm.
I. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM
Một trong những đặc điểm quan trọng của IBV luôn có sự đột biến liên tục tạo ra những biến chủng IBV mới bao gồm 6 genotype GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI đặc biệt trong genotype 1 bao gồm 27 dòng khác nhau và có những chủng được phát hiện rộng rãi trên thế giới như Mass, 4/91, D274 và Qx. Các chủng IBV này thường không gây miễn dịch chéo với nhau nên việc trị và kiểm soát dịch bệnh IB trở nên khó khăn hơn.
Hiện nay, vắc xin là yếu tố chính trong phòng và kiểm soát bệnh viêm phế quản truyền nhiễm. Trên thị trường chủng sử dụng cho vắc xin bao gồm nhiều dòng IB chủng Massachusets 41, biến chủng 793B và IB QX-LIKE, chủng IBV Variant-2 Virus (GI-23), IB dòng GI-13, IB H120, IB 4/91 (GII),… Trong số các chủng này, chủng Mass thường hay được sử dụng trong vắc xin, trong các kit chẩn đoán, xét nghiệm IBV. Tuy nhiên, chủng này hiện ngày càng dần ít xuất hiện ở ngoài thực địa hơn, mà thay vào đó là các biến chủng khác.
Sau khi tiêm phòng vắc xin thì việc giám sát chủ động sau tiêm phòng để kiểm soát hiệu quả phòng bệnh của vắc xin là quan trọng. Phương pháp sử dụng xác định kháng thể là ELISA, ngăn ngưng kết hồng cầu (HI). Phương pháp ELISA có ưu điểm về khả năng phát hiện kháng thể đặc hiệu. Nhược điểm các kit ELISA gặp phải một vấn đề lớn đó là việc IBV có quá nhiều biến chủng đang lưu hành, các biến chủng lại ít có miễn dịch chéo, trong khi đó các kit ELISA lại chủ yếu phát triển dựa trên IBV chủng Mass. Điều này đặt ra một vấn đề về độ đặc hiệu thực tế của các kit ELISA thương phẩm khi được sử dụng để chẩn đoán kháng thể của một số biến chủng IB sử dụng trong vắc xin và đánh giá độ bảo hộ vắc xin với chủng lưu hành tại thực địa.
Đối với phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu, đây là một phương pháp được coi là tiêu chuẩn vàng (Gold standard) trong đánh giá bảo hộ của vắc xin với các chủng vi rút sử dụng làm HI. Ưu điểm của phương pháp Định lượng kháng thể kháng vi rút IBV với chủng vi rút sử dụng làm vắc xin và các chủng vi rút lưu hành tại thực địa, đánh giá được bảo hộ của vắc xin với chủng vi rút lưu hành tại thực địa.
II. PHƯƠNG PHÁP NGĂN TRỞ NGƯNG KẾT HỒNG CẦU XÁC ĐỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT IBV
2.1. Nguyên lý phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu
2.2. Thực hiện HI để định lượng kháng thể kháng vi rút IBV
Chuẩn bị kháng nguyên:

Chủng vi rút IBV bao gồm các chủng tham chiếu sử dụng trong các loại vắc xin như IB 4/91, IB M41, IB H120, IB QX, IB Variant 2,… và chủng vi rút phân lập từ thực địa được nuôi cấy trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi. Trứng sau đó được nuôi 370C theo dõi phôi. Sau 48-72h thu dịch niệu mô. Dịch niệu mô (nước trứng) được ly tâm thu lại dịch nổi và tinh sạch thu vi rút. Sau đó tiến hành xử lý enzyme nước trứng tạo kháng nguyên làm HA-HI.
Chuẩn bị hồng cầu gà
Gà sử dụng lấy hồng cầu là gà trống âm tính kháng thể kháng vi rút IBV và được giám sát định kỳ kháng thể kháng vi rút IBV. Mẫu máu được hòa tan trong chất chống đông natri citrate 5% theo tỉ lệ 4:1. Hồng cầu sau đó được pha loãng vào dung dịch PBS 1X pH 7.2 theo tỉ lệ 1:10 để rửa. Hồng cầu sẽ được ly tâm ở 1500rpm trong 10 phút để loại bỏ dịch nổi cùng lớp màng trắng phía trên hồng cầu. Bước rửa sẽ được lặp lại 4 lần. Hồng cầu đặc sau khi rửa được bảo quản trong PBS 1X pH 7.2 trong vòng 1 tuần ở 40C.
Xử lý huyết thanh
Máu gà được ly tâm 4000rpm trong 10 phút thu huyết thanh. Huyết thanh được xử lý nhiệt ở 560C trong 30 phút. Huyết thanh bất hoạt sau trộn với kaolin 25% để loại bỏ các thành phần không đặc hiệu. Hỗn hợp sẽ được ủ ở 370C trong 1h, sau đó sẽ được ly tâm nhanh để thu lại huyết thanh, loại phần kaolin. Huyết thanh sẽ được bảo quản ở 40C cho tới khi sử dụng.
Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu (HA)
Trên đĩa 96 giếng đáy chữ U, 25µl dung dịch HBS pH 6.5 sẽ được nhỏ vào mỗi giếng. 25µl kháng nguyên đã xử lý sẽ được nhỏ vào giếng pha loãng theo cơ số 2. Sau đó, 25µl dung dịch hồng cầu 0.8% sẽ được nhỏ vào mỗi giếng. Đĩa sẽ được dán kính và ủ trong 45 - 60 phút ở 4oC. Hiệu giá vi rút là độ pha loãng cuối cùng có ngưng kết hồng cầu được tính là đơn vị HA.
Dựa trên kết quả HA, kháng nguyên sẽ được pha loãng về tỉ lệ 4 HAU. Mẫu kháng nguyễn 4HAU sẽ được dùng để thực hiện HA một lần nữa ở ba nồng độ pha loãng 2-1, 2-2 và 2-3 để xác nhận nồng độ 4 HAU.
Kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
Thực hiện trên đĩa 96 giếng đáy chữ U. Huyết thanh pha loãng theo cơ số: 25µl HBS pH 6.5 sẽ được thêm vào mỗi giếng. 25µl huyết thanh đã xử lý được nhỏ vào giếng đầu tiên mỗi hàng. Huyết thanh sẽ được pha loãng theo cơ số 2. Sau khi pha loãng, hút bỏ 25µl dung dịch ở giếng cuối cùng mỗi hàng. Cho 25µl kháng nguyên đã xử lý enzyme ở nồng độ 4HAU được nhỏ vào mỗi giếng. Đĩa sẽ được ủ ở 4oC trong 1 giờ. Sau khi ủ, 25µl hồng cầu gà 0.8% sẽ được nhỏ vào mỗi giếng và tiếp tục ủ ở 4oC. Đọc kết quả sau 45 - 60 phút.
Hiệu giá kháng thể là nồng độ pha loãng cuối cùng có hiện tương ngăn trở ngưng kết hồng cầu. Hiệu giá được tính theo 2n (n là hệ số pha loãng huyết thanh). 
Phân tích kết quả
Mỗi lần xét nghiệm ít nhất 20 mẫu đánh giá chỉ số: Tỷ lệ % dương tính, Giá trị GMP (Giá trị trung bình kháng thể), Hệ số biến thiên (%CV) của hiệu giá kháng thể.
2.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phản ứng HI xác định kháng thể kháng vi rút IBV
Các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp bao gồm: Độ chính xác (độ đúng và độ chụm), độ nhạy và độ đặc hiệu.
Mẫu chuẩn dùng xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp HI.
Mẫu dương tính: 20 mẫu huyết thanh vịt dương tính kháng thể kháng vi rút IBV bằng phương pháp ELISA.
Mẫu âm tính: 20 mẫu huyết t hanh vịt lấy từ vịt không tiêm vắc xin IB âm tính kháng thể kháng vi rút IBV bằng phương pháp ELISA.
Độ chụm:
Mẫu sử dụng: 01 huyết thanh dương, 01 huyết thanh âm.
Lặp lại thí nghiệm 10 lần.
Xác định độ chụm theo công thức PCA Precision Categorical Agreement.
                        PCA(%) = X/N x100
                        X là số lần có kết quả không sai lệch ±1 log2
                        N là tổng số kết quả thí nghiệm
                        Tiêu chuẩn: PCA(%) ≥ 95%
Độ đúng:
            Mẫu sử dụng: 20 huyết thanh dương, 20 huyết thanh âm.
            Xác định độ đúng theo công thức CA Categorical Agreement.
                        CA(%) = Y/N x100
                        X là số kết quả không sai lệch ±1 log2
                        N là tổng số kết quả thí nghiệm
                        Tiêu chuẩn: CA(%) ≥ 90%
Độ nhạy và độ đặc hiệu
Mẫu sử dụng: 20 huyết thanh dương, 20 huyết thanh âm.
Xác định độ nhạy SE Sensitivy, độ đặc hiệu SP Specificity.
                             SE(%) = a/(a+c) x100
                             SP(%) = d/(d+b)x100
                             Tiêu chuẩn: SE(%) ≥ 90%, SP(%) ≥ 90%
III. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP NGĂN TRỞ NGƯNG KẾT HỒNG CẦU HI ĐÁNH GIÁ KHÁNG THỂ KHÁNG IBV 
3.1. Giám sát và đánh giá hiệu quả tiêm phòng vắc xin IB
Định lượng kháng thể kháng vi rút IB chủng vắc xin: IB 4/91, IB M41, IB H120, IB QX, IB Variant 2,…
Số mẫu tối thiểu 20 mẫu/lần.
Thu thập dữ liệu dựa trên kết quả đánh giá định kỳ đánh giá thực trạng bảo hộ chủng vắc xin.
3.2. Đánh giá mức độ bảo hộ với các chủng lưu hành tại thực địa
Trong trường hợp tiêm phòng vắc xin IB nhưng dịch IB vẫn nổ ra gây thiệt hại tại các trại. Điều này có thể do chủng IB lưu hành tại thực tế là biến chủng không tương đồng với chủng sử dụng vắc xin (do IB có miễn dịch chéo thấp giữa các biến chủng). 
Tại Fivevet chúng tôi tiến hành phân lập thu thập chủng IB trên thực địa. Những chủng vi rút phân lập này được sử dụng để đánh giá mức độ bảo hộ khi sử dụng vắc xin IB với chủng lưu hành tại thực địa. Việc thành công trong chế kháng nguyên IBV cho HI là công cụ để chúng tôi có thể đánh giá được bảo hộ thực tế theo yêu cầu khách hàng.
Định lượng kháng thể kháng vi rút IB sử dụng chủng lưu hành tại thực Việt Nam từ đó đánh giá tỉ lệ bảo hộ thực tế của vắc xin và có chiến lược lựa chọn vắc xin phù hợp.
Fivevet tự hào vắc xin Việt – Chủng đại diện Việt Nam – Miễn dịch đặc hiệu.
Xem thêm:
Fivevet phát triển vắc xin Five-Colivac phòng bệnh sưng phù đầu ở lợn
Bệnh Coryza trên gà và giải pháp phòng, trị bệnh
Vắc xin dịch tả lợn và hiệu quả phòng bệnh
 
Chia sẻ :
Ý KIẾN PHẢN HỒI

BÀI VIẾT LIÊN QUAN