I. Một vài nét về bệnh Dịch tả lợn Châu phi (ASF)
Bệnh dịch tả lợn châu Phi là bệnh truyền nhiễm gây sốt cao, xuất huyết với tỉ lệ ốm có thể lên đến 100%. ASF do một loại virus gây ra tên là ASFV. ASFV là virus ADN thuộc họ Asfarviridae, giống Asfivirus. Thời gian ủ bệnh trong tự nhiên thường 4-19 ngày. Các chủng virus có độc lực cao gây xuất huyết bán cấp tính và cấp tính có đặc điểm sốt cao, bỏ ăn uống, xuất huyết ở da và các cơ quan nội tạng, chết trong vòng 4-10 ngày, đôi khi chết ngay cả trước khi có dấu hiệu lâm sàng đầu tiên. Các chủng có độc lực thấp hơn có triệu chứng lâm sàng không điển hình như sốt nhẹ, giảm ăn và mệt mõi, dễ bị nhầm lẫn với một số tình trạng bệnh lý khác của lợn.
Phát hiện virus ASF bằng phương pháp PCR/qPCR
ASF là bệnh có khả năng gây tử vong ở hầu hết các lợn bị nhiễm bệnh. Sự lây lan liên tục từ châu Phi đến châu Âu và gần đây lây lan sang các quốc gia sản xuất lợn lớn như Trung Quốc và các quốc gia Đông Nam Á khác (trong đó có Việt Nam). Điều này đe dọa đến an ninh lương thực thách thức sinh kế của người chăn nuôi lợn, làm mất chuỗi cung cấp lợn, chi phí kiểm soát dịch bệnh.
ASF có thể lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp giữa các động vật bị lây nhiễm và qua việc ăn phải thịt lợn nhiễm bệnh và các vật liệu bị ô nhiễm khác. Các vật trung gian như quần áo, xe tải vận chuyển hoặc thức ăn chăn nuôi có thể đóng vai trò là nguồn lây nhiễm.
ASF được chứng minh là tồn tại trong thịt từ những con lợn bị nhiễm bệnh khi được bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4oC trong vài tháng. Trong mỡ da có thể tồn tại lên đến 300 ngày, trong thịt muối khô có thể tồn tại tối đa 120 ngày, trong giăm bông nước muối có thể lên đến 180 ngày. Ở nhiệt độ 4oC, virus tồn tại hơn 1 năm trong máu, trong thịt có thể tồn tại vài tháng và có thể tồn tại vài năm trong xác đông lạnh. Với số liệu này thì thật dễ hiểu tại sao và bằng cách nào thịt và các sản phẩm từ thịt bị nhiễm virus đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây lan virus. Vì vậy cần giám sát để phát hiện sớm các đợt dịch, kiểm soát và ứng phó với dịch một cách nhanh chóng và hiệu quả để ngăn ngừa sự lây lan của virus. Giám sát tích cực trong ngành chăn nuôi trong nước bao gồm chẩn đoán xét nghiệm đối với lợn sống hoặc lợn chết để tìm sự hiện diện của virus sớm nhất. Vì vậy xét nghiệm thường quy có thể có thể trở thành một phần của giám sát. Xét nghiệm PCR xác định virus gây bệnh Dịch tả lợn châu Phi đang là phương pháp nhanh và chính xác nhất để phát hiện sớm virus ASFV, giảm thiểu tổn thất cho người chăn nuôi.
Ảnh phân bố không gian của các đợt bùng phát dịch tả lợn châu Phi (ASF) được báo cáo ở lợn nhà và các trường hợp ở lợn rừng vào năm 2018 và 2019 tại Châu Âu và Đông Á, trên bản đồ raster về mật độ lợn. Cả hai bản đồ đều được hiển thị ở cùng độ phân giải.II. Phát hiện virus ASF bằng phương pháp PCR
Polymerase chain reaction (PCR): là một kỹ thuật trong phòng thí nghiệm để khuếch đại các đoạn DNA cụ thể cho nhiều ứng dụng trong phòng thí nghiệm và lâm sàng. PCR cho phép khuếch đại hàng tỷ lần các đoạn mục tiêu cụ thể. Phản ứng này trở thành công cụ cho việc phát hiện virus, vi khuẩn gây bệnh trên động vật. Vì vậy để phát hiện sớm virus ASF chúng ta sử dụng phương pháp PCR-ASF để xác định sớm nhất Virus ASFV.
Mẫu bệnh phẩm: Máu chống đông, lách, hạch bạch huyết, hạch amydal, thận, dịch nổi tế bào,…
Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện 2oC- 8oC.
Tách chiết DNA: sử dụng kit tách gồm 3 giai đoạn chính:
Giai đoạn 1 (Lyse): dung dịch lysic làm mất ổn định các liên kết yếu tạo điều kiện cho nucleic acid có thể liên kết với màng silicat.
Giai đoạn 2 (Washing): loại bỏ các protein, polysaccharide và muối thừa.
Giai đoạn 3 (Elute): thu mẫu DNA.
Sau khi tách chiết và thu được DNA tiếp theo sẽ làm phản ứng PCR để xác định virus ASF.
Thành phần phản ứng PCR: DNA, Primer ASF (mồi ngược và mồi xuôi), dNTP, Enzyme DNA polymerase, môi trường đệm.
PCR bao gồm 3 giai đoạn chính: Biến tính, lai hóa/ủ, kéo dài/khuếch đại. Trong giai đoạn biến tính, DNA được đun nóng đến 95oC để phân tách các liên kết hydro giữa các cặp bazo trong mạch khuôn DNA tách DNA mạch đôi thành 2 DNA mạch đơn. Ngay sau khi biến tính quá trình lai hóa (bắt mồi) xảy ra ở nhiệt độ 62oC cho phép đoạn mồi liên kết với DNA mạch đơn tại các vị trí bổ sung tương ứng của chúng. Cuối cùng nhiệt độ đưa lên đến 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của Enzym Taq polymerase để kéo các dNTP tổng hợp nên mạch bổ sung. Phản ứng xảy ra với 30-40 chu kỳ.
Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu trìnhSau khi kết thúc phản ứng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 - 2%.
Sản phẩm PCR có band bằng với ĐC+ và có band khoảng 257bp.
Ảnh điện di Sp PCR ASFIII. Phát hiện virus ASF bằng phương pháp qPCR
Realtime PCR (qPCR): là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng nên được gọi là realtime; và do đặc điểm này nên với qPCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại hay không vì kết quả hiển thị ngay sau khi hoàn thành phản ứng khuếch đại.
Phản ứng qPCR ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix còn có chứa 2 thành phần quan trọng là 1: Probe, là oligonucleotides có trình tự bổ sung đặc hiệu từ DNA đích với đầu 5’ gắn chất huỳnh quang (Reporter) còn đầu 3’ gắn chất hấp phụ tương ứng (Quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang từ reporter. Và 2 là Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease có khả năng thủy phân Probe khí Probe này bắt cặp lên khuân DNA. Khiến cho máy đọc có thể đọc tín hiệu huỳnh quang.
Nguyên lý phản ứng qPCRKết quả của phản ứng Realtime PCR được hiển thị thông qua chỉ số Ct (Cq).
Vậy chỉ số Ct là gì?
Ct value (threshold cycle value) được gọi là giá trị chu kỳ ngưỡng. Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại một thời điểm thiết bị Realtime PCR (Real-time Polymerase Chain Reaction) bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng PCR vượt qua cường độ huỳnh quang nền, hay nói một cách dễ hiểu là số chu kỳ máy phải chạy để phát hiện được tín hiệu huỳnh quang từ mẫu bệnh phẩm. Do đó Ct value tỷ lệ nghịch với nồng độ virus bởi mẫu càng nhiều virus thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện sớm ở những chu kỳ đầu tiên (Ct nhỏ), và ngược lại mẫu càng ít virus thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện muộn ở những chu kỳ lớn (Ct lớn).
Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệtPhản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.
Đánh giá kết quả Ct trong xét nghiệm phát hiện virus gây bệnh ASF:
+ Mẫu dương tính khi giá trị Ct < 40.
+ Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct.
+ Mẫu nghi ngờ khi giá trị 40 ≤ Ct ≤ 45.
>> Đánh giá kết quả: mẫu có virus gây bệnh dịch tả lợn châu Phi khi kết quả realtime PCR dương tính. Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.
Ảnh kết quả qPCR ASFIV. Một số kết quả nghiên cứu về ASF:
Bảng 1. Triệu chứng chủ yếu của lợn mắc bệnh Dịch tả lợn Châu phi ở huyện Quỳnh Phụ, Thái Bình
Bảng 2: Kết quả xác định virus gây bệnh Dịch tả lợn Châu phi từ lợn bệnh tại Quỳnh Phụ, Thái Bình
Bảng 3: Kết quả kiểm tra virus gây bệnh Dịch tả lợn Châu phi ở các mẫu trung gian(Nguồn: Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2021, 19(11): 1436-1445)
Như vậy, đồ dùng dụng cụ và các chất thải trong chăn nuôi như nước thải, thức ăn thừa, cũng như côn trùng ở trong những chuồng nuôi, khu chăn nuôi bị mắc dịch tả lợn châu Phi có chứa mầm bệnh.
* Hãy liên hệ FiveLab theo số hotline 0377 499 555 - 0822 120 555 để được tư vấn, lấy mẫu xét nghiệm bệnh ASF nhanh chóng, kịp thời.
-
FIVELAB là Trung tâm Chẩn đoán Xét nghiệm và Kiểm nghiệm Thú y Trung Ương 5, trực thuộc Công ty Cổ phần Thuốc Thú y Trung Ương 5 (
FIVEVET).
- FIVELAB với sứ mệnh "Vì sức khỏe vật nuôi", Fivelab với phương châm: KỊP THỜI - CHÍNH XÁC - TẬN TÂM - BẢO MẬT - TRÁCH NHIỆM mang dịch vụ tốt nhất đến Quý đối tác, khách hàng.
- FiveLab tự hào là một trong số ít đơn vị có:
+ Làm việc 24/7.
+ Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn AN TOÀN SINH HỌC CẤP III, đạt tiêu chuẩn ISO 17025.
>>> Xem thêm:
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
