Phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi là kỹ thuật có giá trị quan trọng trong phát hiện virus sống, giám sát dịch tễ và nghiên cứu vắc xin. Cùng
Fivevet tìm hiểu nguyên lý phân lập virus cúm từ mẫu bệnh phẩm trên hệ thống trứng gà có phôi và ý nghĩa của phương pháp này trong giám sát dịch tễ, nghiên cứu đặc tính virus và phát triển vắc xin.
1. Vì sao cần phân lập virus cúm từ mẫu bệnh phẩm trên trứng gà có phôi?
Virus cúm, hay Influenza virus, là một trong những tác nhân gây nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính nguy hiểm ở người và động vật. Virus có khả năng lây lan nhanh qua giọt bắn, không khí và tiếp xúc với nguồn bệnh, từ đó có thể gây ra các đợt dịch mùa, hoặc thậm chí đại dịch toàn cầu.
Trong chẩn đoán cúm, các kỹ thuật như Real-time RT-PCR, RT-PCR hoặc test nhanh kháng nguyên có vai trò rất quan trọng vì giúp phát hiện nhanh vật chất di truyền hoặc protein của virus trong mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, các phương pháp này không khẳng định được virus còn sống, còn khả năng nhân lên hay tiếp tục gây nhiễm hay không.
Vì vậy, phân lập virus vẫn là phương pháp có giá trị cao trong nghiên cứu vi sinh vật. Theo hướng dẫn giám sát của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc phân lập thành công virus cúm từ mẫu bệnh phẩm giúp chứng minh sự tồn tại của virus sống, đồng thời cung cấp nguyên liệu quan trọng cho các nghiên cứu chuyên sâu như:
- Xác định đặc tính sinh học
- Lập bản đồ kháng nguyên
- Giám sát biến đổi di truyền
- Tuyển chọn chủng phục vụ nghiên cứu vắc xin
Trong các hệ thống nuôi cấy, trứng gà có phôi là mô hình sinh học kinh điển, được sử dụng rộng rãi để phân lập và nhân lên nhiều chủng virus cúm, đặc biệt là virus cúm gia cầm.
2. Mục tiêu của phương pháp phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi là gì?
Mục tiêu chính của phương pháp: Phân lập được chủng virus cúm sống từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng trên hệ thống trứng gà có phôi, phục vụ nghiên cứu, giám sát dịch tễ và đánh giá đặc điểm của virus.
Các mục tiêu cụ thể gồm:
- Xử lý mẫu bệnh phẩm đúng quy trình, đảm bảo loại bỏ tạp trùng và giữ nguyên hoạt lực của virus.
- Nuôi cấy và nhân lên virus cúm trong khoang ối hoặc khoang niệu của trứng gà có phôi đạt tiêu chuẩn.
- Thu hoạch dịch nổi và đánh giá sự hiện diện của virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA).
- Lưu trữ chủng virus phân lập được để phục vụ cho công tác giám sát dịch tễ học và nghiên cứu vắc xin.
3. Virus cúm có đặc điểm cấu trúc và phân loại như thế nào?
3.1 Virus cúm được phân loại thành những type nào?
Virus cúm thuộc họ
Orthomyxoviridae, là virus có vỏ bọc lipid, vật chất di truyền là RNA sợi đơn, phân đoạn, mang cực tính âm. Dựa vào đặc điểm kháng nguyên của nucleoprotein (NP) và matrix protein (M), virus cúm được phân thành 4 type: A, B, C và D.
-
Virus cúm A: Có phạm vi vật chủ rộng lớn (người, gia cầm, lợn, ngựa,...), có khả năng biến đổi kháng nguyên mạnh mẽ qua hai cơ chế: đột biến điểm (Antigenic drift) và tái tổ hợp phân đoạn RNA (Antigenic shift), là tác nhân chính gây ra các đại dịch lớn.
-
Virus cúm B: Chủ yếu gây bệnh ở người, thường gây dịch theo mùa và ít biến đổi hơn cúm A.
-
Virus cúm C, D: Gây bệnh nhẹ ở người hoặc chỉ khu trú trên một số loài động vật (như lợn, gia súc) và ít có ý nghĩa dịch tễ lâm sàng nghiêm trọng.
Trên bề mặt vỏ bọc của virus cúm (đặc biệt là cúm A và B) có hai gai glycoprotein kháng nguyên quyết định tính hướng tế bào và khả năng gây bệnh:
-
Hemagglutinin (HA): Giúp virus bám vào thụ thể chứa acid sialic trên bề mặt tế bào vật chủ để xâm nhập. HA cũng có đặc tính gắn kết với hồng cầu của một số loài động vật (gà, vịt, động vật có vú), gây ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
-
Neuraminidase (NA): Là một enzyme cắt liên kết acid sialic, giúp các virus mới hình thành giải phóng ra khỏi tế bào vật chủ để tiếp tục đi lây nhiễm tế bào khác.
Đặc điểm cấu trúc virus cúm
3.2. Vì sao trứng gà có phôi được sử dụng để nuôi cấy và phân lập virus cúm?
Trứng gà có phôi (thường từ 9–11 ngày tuổi) được ví như một "bình phản ứng sinh học" hoàn chỉnh và vô trùng. Các màng bao quanh phôi bao gồm: màng niệu (allantoic membrane), màng ối (amniotic membrane) và màng nhau (chorioallantoic membrane).
- Theo các tài liệu kỹ thuật của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC Hoa Kỳ), các tế bào biểu mô màng niệu và màng ối của phôi gà rất giàu các thụ thể chứa acid sialic liên kết α-2,3 (phù hợp với virus cúm gia cầm) và một lượng nhất định liên kết α-2,6 (phù hợp với virus cúm người).
- Khi virus được tiêm vào các khoang này, chúng sẽ bám vào tế bào biểu mô, xâm nhập, cởi vỏ, nhân bản RNA trong nhân tế bào, lắp ráp và giải phóng một lượng lớn hạt virus mới vào dịch khoang niệu hoặc dịch khoang ối.
Đây là cơ sở giúp trứng gà có phôi trở thành phương pháp kinh điển trong phân lập virus cúm và cũng là nền tảng quan trọng trong một số quy trình sản xuất vắc xin cúm.
4. Cần lưu ý gì về an toàn sinh học khi phân lập virus cúm?
Khuyến cáo An toàn sinh học (Biosafety): Để bảo đảm an toàn sinh học, cẩm nang phòng thí nghiệm của WHO và CDC quy định việc phân lập virus cúm cần được thực hiện trong phòng thí nghiệm chuyên môn, có điều kiện an toàn sinh học phù hợp (BSL-2 hoặc BSL-3 tùy chủng độc lực) và bởi nhân sự được đào tạo. Nội dung dưới đây chỉ trình bày ở mức nguyên lý, không thay thế quy trình thao tác chuẩn trong phòng thí nghiệm.
- Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng kháng sinh sau đó ly tâm.
- Tiêm vào trứng 9-11 ngày.
- Soi trứng & ủ 35°C.
- Thu hoạch dịch phôi.
- Xét nghiệm HA / RT-PCR.
- Đánh giá kết quả & lưu trữ.
4.1 Những vật liệu nào được sử dụng trong phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi?
- Mẫu bệnh phẩm: Dịch ngoáy tăm bông đường hô hấp (hầu họng, mũi, ổ nhớp ở gia cầm) được bảo quản trong môi trường vận chuyển chuyên dụng ở điều kiện lạnh.
- Hệ thống sống: Trứng gà có phôi đạt tiêu chuẩn sạch bệnh (SPF - Specific Pathogen Free) hoặc trứng từ các đàn gà khỏe mạnh không có kháng thể kháng cúm, đạt từ 9 đến 11 ngày tuổi.
- Hồng cầu chỉ thị: Huyền dịch hồng cầu gà nồng độ 0.5% – 1% đã được chuẩn hóa.
4.2. Các bước thực hiện phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi gồm những gì?
-
Xử lý mẫu bệnh phẩm: Mẫu được bổ sung hỗn hợp kháng sinh phổ rộng (để tiêu diệt vi khuẩn và vi nấm cộng sinh trong đường hô hấp), sau đó ly tâm tốc độ cao để thu dịch trong, loại bỏ cặn tế bào.
-
Chuẩn bị trứng: Trứng gà được soi dưới ánh sáng để xác định vị trí túi khí, vị trí phôi sống (mạch máu phát triển rõ ràng) và đánh dấu điểm tiêm thích hợp.
-
Tiêm virus vào trứng: Tiến hành đục lỗ vô trùng trên vỏ trứng và tiêm một lượng dịch mẫu xác định vào khoang niệu hoặc khoang ối tùy thuộc vào đích phân lập chủng cúm (cúm gia cầm ưu tiên khoang niệu). Sáp hoặc keo vô trùng được dùng để gắn kín lỗ đục.
-
Ủ trứng và theo dõi: Trứng sau khi tiêm được đặt vào tủ ủ ở nhiệt độ thích hợp (thường từ 35oC đến 37oC tùy thuộc vào chủng virus nghi ngờ) và theo dõi hằng ngày bằng đèn soi trứng. Những trứng chết trong vòng 24 giờ đầu được loại bỏ (do sốc tiêm hoặc nhiễm khuẩn). Trứng chết sau 24 giờ hoặc sống đến hết thời gian ủ (48–72 giờ) sẽ được chuyển vào tủ lạnh 4oC vài giờ để làm co mạch máu trước khi thu hoạch.
-
Thu hoạch dịch phôi: Tiến hành hút dịch khoang niệu hoặc khoang ối trong điều kiện vô trùng tuyệt đối tại tủ an toàn sinh học cấp 2.
Phương pháp thực hiện tổng quan
5. Làm thế nào để đánh giá kết quả phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi?
Sự nhân lên của virus cúm trong dịch trứng không phải lúc nào cũng làm chết phôi hoặc tạo tổn thương rõ rệt ở biểu mô (ngoại trừ các chủng cúm gia cầm độc lực cao - HPAI). Vì vậy, kết quả phân lập cần được đánh giá bằng các xét nghiệm sàng lọc và định danh phù hợp.
5.1. Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA dùng để phát hiện virus cúm như thế nào?
- Nguyên lý: Kháng nguyên Hemagglutinin trên bề mặt virus cúm liên kết với thụ thể trên màng hồng cầu gà, tạo thành một mạng lưới liên kết ba chiều lơ lửng, không cho hồng cầu lắng xuống đáy giếng (tạo hiện tượng "màng lưới"). Nếu không có virus, hồng cầu sẽ tự do lắng xuống đáy tạo thành một "chấm đỏ" sắc nét.
- Đánh giá: Dịch trứng cho phản ứng HA dương tính chứng tỏ có sự hiện diện của một tác nhân gây ngưng kết hồng cầu (nghi ngờ cao là virus cúm).
5.2. Vì sao cần kết hợp phản ứng HI, RT-PCR hoặc giải trình tự gen sau khi có kết quả HA dương tính?
Để khẳng định chắc chắn tác nhân phân lập được là virus cúm và xác định cụ thể phân type (ví dụ: H5N1, H1N1, H3N2), dịch thu hoạch dương tính với HA sẽ tiếp tục được đem đi làm phản ứng HI (sử dụng kháng thể chuẩn đặc hiệu) hoặc chạy kỹ thuật sinh học phân tử Real-time RT-PCR và giải trình tự gen.
6. Phương pháp phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi có ưu điểm, hạn chế và ứng dụng gì?
Ưu điểm: Trứng gà có phôi là môi trường nuôi cấy có độ nhạy cực cao đối với đại đa số các chủng virus cúm. Lượng virus sinh ra trong dịch khoang niệu thường đạt nồng độ rất lớn (10⁹–10¹⁰ hạt virus/ml), dễ thu hoạch và ít bị lẫn tạp chất protein phức tạp như trong nuôi cấy tế bào. Đây cũng là lý do vì sao hệ thống này vẫn là nền tảng cốt lõi trong quy trình sản xuất vắc xin cúm mùa toàn cầu hiện nay.
Hạn chế: Quá trình phân lập phụ thuộc lớn vào nguồn cung cấp trứng đạt chuẩn sinh học, sạch bệnh (SPF) và đòi hỏi tính chu kỳ thời gian nghiêm ngặt.
Ứng dụng của chủng virus phân lập: Các chủng virus cúm sống được phân lập thành công từ nghiên cứu này sẽ đóng vai trò như một "ngân hàng sinh học". Chúng là nguồn tài nguyên vô giá phục vụ cho chiến lược "Một sức khỏe" (One Health): giúp liên kết dữ liệu dịch tễ giữa người và động vật, dự báo sớm nguy cơ bùng phát đại dịch, đánh giá mức độ nhạy cảm hoặc kháng thuốc của các chủng virus đối với các thuốc kháng virus hiện tại (như Oseltamivir) và cập nhật thành phần kháng nguyên cho các lô vắc xin thế hệ mới.
7. Phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi có ý nghĩa gì trong giám sát dịch bệnh?
Phương pháp phân lập virus cúm từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng trên hệ thống trứng gà có phôi là một kỹ thuật y sinh học kinh điển, có độ tin cậy và giá trị thực tiễn cao. Kết quả phân lập cung cấp bằng chứng trực tiếp về sự lưu hành của các hạt virus sống ngoài quần thể. Việc duy trì, chuẩn hóa và vận hành tốt quy trình phân lập này tại các phòng thí nghiệm chuyên sâu là chìa khóa then chốt giúp nâng cao năng lực giám sát dịch tễ, chủ động ứng phó với các biến chủng nguy hiểm của virus cúm nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet).
Tài liệu tham khảo
1. World Health Organization (WHO). Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. Geneva: WHO Press.
2. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Influenza Division Laboratory Methods for the Diagnosis and Characterization of Influenza Viruses. Atlanta, GA.
3. Webster, R. G., Monto, A. S., Braciale, T. J., & Lamb, R. A. Textbook of Influenza. Wiley-Blackwell.
4. Knipe, D. M., & Howley, P. M. Fields Virology. Wolters Kluwer Health.
5. World Organisation for Animal Health (WOAH). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris: WOAH.
Câu hỏi thường gặp
1. Phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi dùng để làm gì?
Phân lập virus cúm trên trứng gà có phôi giúp phát hiện sự hiện diện của virus sống trong mẫu bệnh phẩm. Phương pháp này có giá trị trong nghiên cứu đặc tính virus, giám sát dịch tễ, giải trình tự gen và phục vụ phát triển vắc xin.
2. Vì sao cần phân lập virus cúm khi đã có Real-time RT-PCR?
Real-time RT-PCR giúp phát hiện vật chất di truyền của virus trong mẫu bệnh phẩm, nhưng không khẳng định được virus còn sống hay còn khả năng nhân lên. Trong khi đó, phân lập virus giúp chứng minh sự tồn tại của virus sống, có giá trị cao trong nghiên cứu chuyên sâu.
3. Vì sao trứng gà có phôi được sử dụng để phân lập virus cúm?
Trứng gà có phôi là hệ thống sinh học sống, có các tế bào phù hợp cho virus cúm bám dính, xâm nhập và nhân lên. Đây là mô hình kinh điển, đặc biệt phù hợp với nhiều chủng virus cúm gia cầm.
4. Kết quả HA dương tính có khẳng định chắc chắn là virus cúm không?
Không hoàn toàn. Phản ứng HA dương tính cho thấy có tác nhân gây ngưng kết hồng cầu trong dịch phôi, trong đó virus cúm là nghi ngờ quan trọng. Để khẳng định, cần kết hợp thêm các kỹ thuật như HI, RT-PCR, Real-time RT-PCR hoặc giải trình tự gen.
5. Chủng virus cúm phân lập được có ý nghĩa gì trong giám sát dịch tễ?
Chủng virus cúm phân lập được là nguồn vật liệu sinh học quan trọng để đánh giá đặc tính virus, theo dõi biến đổi di truyền, xác định mối liên hệ giữa các ổ dịch và hỗ trợ cập nhật thành phần kháng nguyên cho vắc xin.
Xem thêm:
-
TẠI SAO VI KHUẨN HAEMOPHILUS PARAGALLINARUM CÔNG CƯỜNG ĐỘC LẠI KHÔNG CÓ DẤU HIỆU BỆNH TRÊN GÀ?
-
TÁCH CHIẾT TỰ ĐỘNG LÀ GÌ? NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG VÀ LỢI ÍCH TRONG XÉT NGHIỆM SINH HỌC
-
HƯỚNG DẪN BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO DÒNG TỪ A–Z CHUẨN SOP PHÒNG THÍ NGHIỆM
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
