NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHẬN DIỆN SỚM SỰ CỐ KỸ THUẬT (Phần I)

Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu sinh học, phát triển thuốc, sản xuất vắc xin và liệu pháp tế bào. Cùng Fivevet tổng hợp 6 vấn đề thường gặp trong nuôi cấy tế bào, nguyên nhân và hướng xử lý giúp phòng thí nghiệm duy trì chất lượng mẫu ổn định.

Nuôi cấy tế bào (Cell culture) là một kỹ thuật nền tảng trong nghiên cứu sinh học, y sinh, phát triển thuốc, sản xuất vắc xin và nhiều ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên, ngay cả trong các phòng thí nghiệm được kiểm soát tốt, quá trình nuôi cấy vẫn có thể gặp nhiều sự cố kỹ thuật làm ảnh hưởng đến chất lượng tế bào và độ tin cậy của kết quả thí nghiệm.
Các vấn đề như:
- Tế bào tăng trưởng chậm
- Bong khỏi bề mặt nuôi cấy
- Môi trường đổi màu nhanh
- Tỷ lệ sống giảm sau rã đông
- Nhiễm tạp
- Tế bào không bám dính
Tất cả đều có thể xảy ra nếu điều kiện nuôi cấy chưa tối ưu. Việc nhận biết sớm nguyên nhân và áp dụng biện pháp khắc phục phù hợp sẽ giúp phòng thí nghiệm hạn chế rủi ro, giảm sai lệch kết quả và duy trì sự ổn định của dòng tế bào.

Tế bào tăng trưởng chậm là một trong những vấn đề phổ biến trong nuôi cấy tế bào. Hiện tượng này thường không xuất hiện đột ngột mà tiến triển dần qua nhiều lần cấy chuyền. Tế bào có thể nhân đôi chậm hơn bình thường, đạt mật độ thấp, thời gian để đạt mức che phủ bề mặt (monolayer) kéo dài (thường 24-48 giờ) và xuất hiện nhiều khoảng trống giữa các cụm tế bào.
Về hình thái, tế bào bám dính thường nhỏ hơn bình thường, chất nguyên sinh co lại, giảm khả năng bám dính, ít hình thành chân giả và có hình dạng không đồng nhất. Một số tế bào có thể tròn lại, bong nhẹ hoặc nổi lơ lửng. Với tế bào nuôi lơ lửng, mật độ tế bào thường thấp, phân bố không đều và xuất hiện nhiều mảnh tế bào chết trong môi trường.
Dưới kính hiển vi, tế bào thể hiện dấu hiệu stress như giảm số lượng tế bào đang phân chia, hình thái kém đồng nhất; đồng thời tỷ lệ tế bào sống (viability) giảm dần qua các lần cấy chuyền.
Về mặt sinh học, tế bào ở trạng thái này đang bị stress, làm giảm chuyển hóa năng lượng, giảm tổng hợp protein, suy giảm chức năng ty thể, rối loạn chu kỳ phân chia và tăng chết tế bào. Nếu kéo dài, tình trạng này có thể gây lão hóa tế bào, thay đổi biểu hiện gen và làm mất dần đặc tính sinh học ban đầu.
Hậu quả: Làm sai lệch kết quả thí nghiệm do tế bào phản ứng không ổn định với thuốc, cytokine hoặc các yếu tố xử lý, đồng thời làm giảm hiệu quả đưa vật liệu di truyền vào tế bào và tăng nguy cơ nhiễm do thời gian nuôi kéo dài và thao tác nhiều hơn. Hiện tượng này thường là dấu hiệu cho thấy điều kiện nuôi cấy chưa tối ưu và tế bào đang bị stress sinh học. 

- Môi trường nuôi cấy không phù hợp với dòng tế bào: Mỗi dòng tế bào yêu cầu thành phần môi trường khác nhau như DMEM, RPMI-1640 hoặc MEM cùng nồng độ glucose, amino acid và growth factor khác nhau. Khi loại media sử dụng không đáp ứng đúng nhu cầu dinh dưỡng mà dòng tế bào đó cần để phát triển có thể khiến tế bào tăng trưởng chậm, hình thái bất thường hoặc giảm viability (tỷ lệ tế bào sống và hoạt động bình thường).
- Chất lượng FBS hoặc chất bổ sung (supplement) không ổn định: Khi thành phần dinh dưỡng hoặc growth factor trong môi trường thay đổi giữa các lô sản xuất, bảo quản không đúng cách hoặc đã giảm chất lượng, khiến tế bào tăng trưởng kém và hình thái không ổn định.
- Tủ ấm CO₂ sai lệch nhiệt độ hoặc lượng CO₂ không ổn định: Làm pH của môi trường nuôi cấy bị thay đổi (thường do hệ đệm bicarbonate), khiến tế bào bị stress, tăng trưởng chậm, thay đổi hình thái hoặc giảm viability.
- Mật độ seeding chưa tối ưu: Số lượng tế bào gieo ban đầu quá thấp hoặc quá cao so với mức khuyến nghị của từng dòng tế bào, làm ảnh hưởng đến khả năng bám dính, giao tiếp giữa các tế bào (cell-cell communication) và tốc độ tăng trưởng; một số dòng tế bào chỉ phát triển tốt khi đạt mật độ tối thiểu nhất định (cell-cell interaction-dependent), nếu thấp quá sẽ tăng trưởng chậm hoặc không tăng sinh hiệu quả.
- Passage number quá cao làm tế bào lão hóa: Khi tế bào đã được cấy chuyền quá nhiều lần, dẫn đến hiện tượng senescence (lão hóa tế bào), khiến tốc độ phân chia giảm, hình thái thay đổi, tăng kích thước bất thường và giảm khả năng tăng trưởng cũng như đáp ứng với các tín hiệu sinh học.
- Nhiễm Mycoplasma tiềm ẩn: Mycoplasma với kích thước rất nhỏ và không có thành tế bào, tế bào bị nhiễm Mycoplasma không gây đục môi trường hoặc thay đổi rõ ràng bằng mắt thường, tuy nhiên vẫn âm thầm làm giảm tốc độ tăng trưởng, thay đổi chuyển hóa tế bào, ảnh hưởng hình thái và gây sai lệch kết quả thí nghiệm. Mycoplasma không thể nhìn thấy trực tiếp dưới kính hiển vi thông thường; chỉ có thể nghi ngờ qua thay đổi của tế bào và xác nhận bằng các phương pháp xét nghiệm chuyên dụng.
- Quá trình thawing làm giảm khả năng hồi phục của tế bào: Tế bào bị rã đông không đúng tốc độ hoặc xử lý chậm, khiến tinh thể đá và DMSO trong quá trình đông-rã gây tổn thương màng tế bào, làm giảm tỷ lệ sống (viability), tăng apoptosis và khiến tế bào khó bám dính hoặc tăng trưởng trở lại bình thường sau khi nuôi cấy.
Do đó, việc theo dõi định kỳ doubling time, cell morphology và tốc độ tăng trưởng là rất quan trọng để phát hiện sớm bất thường và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào.

Phòng thí nghiệm cần:
- Xác minh đúng loại môi trường cho từng dòng tế bào
- Kiểm tra hạn sử dụng và chất lượng FBS và supplements
- Hiệu chuẩn tủ ấm CO₂ định kỳ
- Kiểm tra Mycoplasma bằng PCR hoặc kit huỳnh quang
- Giảm số passage đối với dòng tế bào nhạy cảm

Tế bào bị bong khỏi bề mặt thường gặp ở các dòng tế bào bám dính (adherent). Khi đó, tế bào không còn bám chắc vào đáy flask mà chuyển sang trạng thái lơ lửng trong môi trường.
Quan sát thực tế có thể thấy xuất hiện nhiều tế bào floating, lớp monolayer bị đứt đoạn, bong thành từng mảng hoặc xuất hiện nhiều vùng trống trên bề mặt nuôi cấy.
Dưới kính hiển vi, tế bào thường chuyển từ dạng trải rộng (spreading) sang hình tròn, co rút, giảm liên kết với bề mặt và giảm tiếp xúc giữa các tế bào. Trong trường hợp nặng, gần như toàn bộ lớp tế bào có thể tách khỏi flask, dẫn đến mất culture nếu không xử lý kịp thời 

- Trypsinization quá mức: Tế bào bị xử lý với trypsin quá lâu hoặc ở nồng độ quá cao, làm phá vỡ protein bám dính trên màng tế bào. Hậu quả là tế bào co tròn, yếu, dễ tổn thương, giảm khả năng bám dính sau khi seed, đồng thời có thể làm giảm tỷ lệ tế bào sống hoạt động bình thường (viability) và tốc độ tăng trưởng ở các passage tiếp theo.
- Bề mặt nuôi cấy không phù hợp: Sử dụng flask/plate không được xử lý bề mặt hoặc không có lớp coating cần thiết cho dòng tế bào, khiến tế bào bám dính kém, tăng trưởng chậm hoặc dễ bong khỏi bề mặt nuôi cấy. Một số dòng tế bào cần coating bằng collagen, fibronectin hoặc poly-L-lysine để tăng khả năng bám dính.
- Stress cơ học khi thao tác: Các lực cơ học trong quá trình thao tác như pipetting mạnh, lắc flask hoặc thay môi trường không nhẹ nhàng có thể làm tổn thương màng tế bào, giảm khả năng bám dính, khiến tế bào dễ bong khỏi bề mặt và làm tăng tỷ lệ chết tế bào.
- Nhiễm vi sinh vật: Nhiễm nấm, vi khuẩn hoặc Mycoplasma có thể làm thay đổi hình thái, giảm khả năng bám dính, khiến tế bào chết và bong khỏi bề mặt nuôi cấy.

- Giảm thời gian xử lý trypsin và giảm nồng độ trypsin-EDTA phù hợp với từng dòng tế bào.
- Sử dụng dụng cụ nuôi cấy đã được phủ lớp bám dính như collagen, fibronectin hoặc poly-L-lysine để giúp tế bào bám tốt hơn và sinh trưởng ổn định hơn.
- Thao tác nhẹ nhàng, hạn chế lực cơ học tác động lên tế bào. Tránh pipetting mạnh, không xịt trực tiếp lên lớp tế bào và hạn chế rung lắc flask nhằm duy trì khả năng bám dính của tế bào.
- Kiểm tra nhiễm định kỳ đối với nấm, vi khuẩn, virus và Mycoplasma để đảm bảo điều kiện nuôi cấy ổn định.

Môi trường nuôi cấy đổi màu quá nhanh, thường từ đỏ sang vàng hoặc tím bất thường sau thời gian ngắn, là dấu hiệu cho thấy pH trong hệ đệm bicarbonate bị thay đổi đột ngột. Hiện tượng này phản ánh tình trạng tế bào hoạt động bất thường, hoặc môi trường bị nhiễm, làm mất cân bằng chuyển hóa và ảnh hưởng trực tiếp đến sự ổn định của tế bào. 

- Tăng trưởng và chuyển hóa tế bào quá mạnh: Tế bào tăng sinh nhanh tạo nhiều acid lactic làm giảm pH môi trường, khiến môi trường chuyển sang màu vàng nhanh hơn bình thường.
- Mật độ tế bào quá cao (quá confluency): Khi số lượng tế bào vượt mức tối ưu, chúng tiêu thụ nhanh glucose và glutamine, làm môi trường nhanh chóng bị acid hóa và đổi màu sớm.
- Tủ ấm CO₂ không ổn định: Sai lệch nồng độ CO₂ hoặc nhiệt độ làm mất cân bằng hệ đệm bicarbonate, dẫn đến pH dao động và màu môi trường thay đổi bất thường.
- Nhiễm vi sinh vật (vi khuẩn hoặc nấm): Vi sinh vật có tốc độ chuyển hóa cao làm môi trường đổi màu rất nhanh, thường kèm theo hiện tượng đục hoặc xuất hiện hạt lơ lửng.

- Giảm mật độ gieo tế bào ban đầu (seeding density)
- Thay môi trường nuôi cấy thường xuyên hơn
- Kiểm tra và hiệu chuẩn hệ thống CO₂ của tủ ấm
- Quan sát kính hiển vi để phát hiện dấu hiệu nhiễm tạp
Ở phần tiếp theo, Fivevet sẽ tiếp tục phân tích các vấn đề quan trọng khác gồm giảm tỷ lệ sống sau rã đông, nhiễm tạp và tế bào không bám dính. Mời bạn đọc cùng đón xem phần II để cập nhật thêm các hướng xử lý giúp tối ưu quy trình nuôi cấy tế bào. 

Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển Vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet)

Câu hỏi thường gặp:
1. Nuôi cấy tế bào là gì?
Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm được kiểm soát về môi trường, dinh dưỡng, nhiệt độ, CO₂ và vô trùng. Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học, phát triển thuốc, sản xuất vắc xin và các thử nghiệm liên quan đến tế bào.
2. Vì sao tế bào bị bong khỏi bề mặt nuôi cấy?
Tế bào có thể bị bong do trypsinization quá mức, bề mặt nuôi cấy không phù hợp, thiếu lớp coating cần thiết hoặc thao tác pipetting quá mạnh. Ngoài ra, tình trạng nhiễm nấm, vi khuẩn hoặc Mycoplasma cũng có thể làm giảm khả năng bám dính của tế bào.
3. Vì sao tế bào nuôi cấy tăng trưởng chậm?
Tế bào tăng trưởng chậm có thể do môi trường nuôi cấy không phù hợp, chất lượng FBS hoặc chất bổ sung không ổn định, mật độ seeding chưa tối ưu, tủ ấm CO₂ sai lệch hoặc số passage quá cao. Ngoài ra, nhiễm Mycoplasma tiềm ẩn cũng có thể làm tế bào phát triển chậm mà không gây đục môi trường rõ ràng.
4. Làm thế nào để nhận biết tế bào đang bị stress?
Tế bào bị stress thường có biểu hiện tăng trưởng chậm, hình thái kém đồng nhất, giảm khả năng bám dính, xuất hiện nhiều tế bào tròn lại hoặc nổi lơ lửng. Với tế bào nuôi lơ lửng, có thể thấy mật độ thấp, phân bố không đều và tăng mảnh tế bào chết trong môi trường.
5. Cần làm gì để hạn chế các sự cố trong nuôi cấy tế bào?
Phòng thí nghiệm cần chọn đúng môi trường cho từng dòng tế bào, kiểm soát chất lượng FBS, tối ưu mật độ seeding, hiệu chuẩn tủ ấm CO₂ định kỳ và thao tác nhẹ nhàng khi thay môi trường hoặc cấy chuyền. Đồng thời, nên kiểm tra nhiễm tạp định kỳ, đặc biệt là Mycoplasma, để duy trì chất lượng dòng tế bào ổn định.
Tài liệu tham khảo:
1. Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 8th Edition. Wiley-Blackwell, 2021.
2. Masters JR. Animal Cell Culture: Practical Approach. Oxford University Press.
3. Geraghty RJ et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer. 2014.
4. ATCC Cell Culture Basics Handbook.
5. Thermo Fisher Scientific. Gibco Cell Culture Protocol Guide.
6. Lonza Bioscience – Cell Culture Troubleshooting Guide.
7. Uphoff CC, Drexler HG. Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology.
8. FDA Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines.
Xem thêm:
- NUÔI CẤY TẾ BÀO: NHẬN DIỆN SỚM SỰ CỐ KỸ THUẬT (Phần II)
- VẮC XIN DỊCH TẢ LỢN VÀ HIỆU QUẢ PHÒNG BỆNH (VẮC XIN FIVE-CSF)
- KHẢ NĂNG TRUYỀN LÂY VI RÚT CÚM TỪ VẬT NUÔI SANG NGƯỜI