Vi rút PCV2 là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh lý nguy hiểm ở lợn, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và kinh tế chăn nuôi. Để kiểm soát hiệu quả dịch bệnh, việc phát hiện và định lượng kháng thể kháng PCV2 đóng vai trò then chốt. Phương pháp IPMA (Immunoperoxidase Monolayer Assay) được đánh giá cao nhờ độ nhạy và đặc hiệu vượt trội trong chẩn đoán huyết thanh học. Bài viết trình bày quy trình thiết lập phương pháp IPMA tại phòng nghiên cứu của
Fivevet, ứng dụng để đo lường hiệu giá kháng thể kháng các genotype PCV2 đang lưu hành như PCV2d và PCV2h. Đây là công cụ hữu ích trong đánh giá hiệu quả vắc xin, giám sát miễn dịch và xây dựng chương trình tiêm phòng phù hợp cho đàn lợn.
Ứng dụng IPMA trong chẩn đoán huyết thanh học phát hiện kháng thể kháng PCV2
I. Tổng quan về vi rút PCV2 và các bệnh lý liên quan
PCV2 (Porcine circorus type 2) là một vi rút DNA nhỏ thuộc họ
Circoviridae, có liên quan đến nhiều bệnh lý ở lợn. PCV2 bao gồm các thể bệnh: Hội chứng còi cọc sau cai sữa (PMWS – Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome); Hội chứng viêm da, suy thận (PDNS – Porcine Dermatitis & Nephropathy Syndrome); Viêm hô hấp phức hợp (PRDC – Porcine Respiratory Disease Complex) và Rối loạn sinh sản, trong đó nổi bật nhất là
hội chứng còi cọc sau cai sữa (PMWS – Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome). PCV2 thường ghép với nhiều bệnh nguy hiểm trên lợn như hô hấp phức hợp, suyễn, glasser,… gây thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi.
PCV2 có 5 loại genotype bao gồm
PCV2a, PCV2b, PCV2c, PCV2d, PCV2e (Turni
& cs., 2021; Valeris-Chacin
& cs., 2021). Trong đó, PCV2a là type lưu hành ban đầu, thường xuất hiện trước 2005. PCV2b thay thế PCV2a trong các đợt bùng phát lớn sau 2005. PCV2d hiện đang là type lưu hành chính trên toàn cầu (trước gọi là PCV2b mutant). PCV2c – ít phổ biến, thường ở châu Âu. Ngoài ra còn có các type hiếm như PCV2e, PCV2f, PCV2h,…
Miễn dịch chéo giữa các Type: Kháng thể kháng PCV2 sinh ra sau khi nhiễm hoặc tiêm vắc xin có khả năng nhận diện nhiều type khác nhau nhờ vào các epitope chung trên capsid protein (ORF2) của PCV2. Tuy nhiên,
hiệu quả miễn dịch chéo giữa các type không hoàn toàn, đặc biệt là giữa PCV2a, PCV2b và PCV2d. PCV2a vắc xin (vắc xin thế hệ đầu tiên) có khả năng bảo vệ chéo tốt đối với PCV2b và PCV2d, nhưng hiệu quả giảm nhẹ với PCV2d do sự biến đổi epitope trên capsid. PCV2b và PCV2d có cấu trúc capsid gần nhau hơn, nên khả năng miễn dịch chéo giữa hai type này tốt hơn so với giữa PCV2a và PCV2d. Miễn dịch chéo không hoàn toàn giải thích tại sao trong thực tế, PCV2d đã thay thế PCV2a/b trong quần thể lợn, dù đã có vắc xin. PCV2c và các type hiếm thường ít gặp và không gây ảnh hưởng lớn đến khả năng bảo vệ (Yu
& cs., 2023). Trên thực tế PCV2d lưu hành mạnh, một số nhà sản xuất đã phát triển vắc xin đa type (bivalen) hoặc vắc xin PCV2d để tăng hiệu quả.
Trong chẩn đoán huyết thanh học, để phát hiện kháng thể kháng vi rút PCV2 có thể sử dụng phương pháp trung hòa VNT (Vi rút Neutralization Test), ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) và phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp - IPMA (Immunoperoxidase Monolayer Assay).
Bảng so sánh giữa các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học của PCV2
IPMA là lựa chọn hợp lý đảm bảo độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng.
II. Quy trình thiết lập phản ứng IPMA tại phòng nghiên cứu công ty Fivevet
Phản ứng IPMA định lượng kháng thể kháng vi rút PCV2
1. Chuẩn bị nguyên vật liệu cho IPMA
Vi rút PCV2 các genotype PCV2d, PCV2d, PCV2h: Được phân lập từ các ổ dịch từ thực địa tại Việt Nam.
Kháng thể đa dòng kháng các genotype PCV2d, PCV2d, PCV2h: Được chế tạo bằng cách gây tối miễn dịch trên chuột lang sử dụng là đối chứng dương nhuộm IPMA.
Tế bào dòng PK15: Nhập từ ATCC là tế bào được kiểm định không nhiễm vi rút PCV1, Mycoplasma.
2. Các bước tiến hành
Xử lý mẫu xét nghiệm: Mẫu huyết thanh để phát hiện kháng thể: máu được lấy vô trùng, lượng tối thiểu là 1 ml, để đông, chắt lấy huyết thanh. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C. Mẫu máu sau đông li tâm lạnh ở 4000 vòng trong 10 phút thu huyết thanh. Huyết thanh sau khi được xử lý bất hoạt ở 56°C trong 30 phút, xử lý kháng sinh trong 60 phút.
Chuẩn bị huyễn dịch tế bào: Tế bào PK15 khi bám đáy 1 lớp được trypsin tách tế bào thành huyễn dịch dạng huyền phù mật độ 3x10
5 tế bào/ml.
Gây nhiễm vi rút: Gây nhiễm vi rút PCV2 các genotype vào tế bào với liều 300TCID
50/ giếng. Nuôi ở 37
0C 5% CO2 trong 4 ngày. Sau đó tế bào được cố định bằng formaline và thực hiện phản ứng IPMA để đọc kết quả.
Cố định tế bào: Tế bào sau gây nhiễm PCV2 4 ngày được cố định bằng formaldehyde 10%, NP40 1% trong 30 phút ở nhiệt độ 37
0C và rửa bằng PBS Tween 80.
Cho mẫu huyết thanh: 50 µL huyết thanh pha loãng nồng độ 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280 trong PBS-Tween 80 1% Skim milk. Ủ trong 30 phút ở 37
0C. Rửa lại 3 lần với PBS-Tween 80.
Cho kháng thể thứ cấp: 50 µL kháng thể gắn enzym peroxidase (anti-Guinea Pig IgG-HRP) đã pha loãng phù hợp trong PBS-Tween 80 1% Skim milk. Ủ trong 30 phút ở 37
0C. Rửa lại 3 lần với PBS-Tween 80.
Cơ chất: 50 µL Cơ chất AEC cho vào mỗi giếng. Ủ ở 37°C trong 30 phút cho đến khi phát triển màu. Rửa lại đĩa bằng nước.
Đọc kết quả: Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 10x–40x. Kết quả dương tính: tế bào biểu hiện màu đỏ nâu đặc trưng trong nhân. Hiệu giá kháng thể là mức pha loãng huyết thanh thấp nhất cho kết quả dương tính rõ ràng khi thực hiện phản ứng IPMA.
Hình ảnh nhuộm tế bào phản ứng IPMA
Ghi chú: Hình bên trái mẫu huyết thanh có kháng thể kháng PCV2, tế bào bắt màu đỏ nâu trong nhân khi có vi rút và được bắt cặp đặc hiệu với kháng thể có trong mẫu huyết thanh. Hình bên phải mẫu huyết thanh không có kháng thể kháng PCV2, tế bào chỉ bắt màu nền nhạt.
3. Đánh giá và phân tích kết quả
Phân tích kết quả dựa vào chỉ số hiệu giá kháng thể trung bình, chỉ số độ biến thiên CV%, chỉ số độ lệch chuẩn kháng thể SE.
4. Ứng dụng phương pháp IPMA trong chẩn đoán miễn dịch lợn
Đánh giá miễn dịch sau tiêm vắc xin: Phương pháp IPMA được áp dụng rộng rãi để xác định mức độ kháng thể kháng vi rút PCV2. Việc theo dõi hiệu giá kháng thể giúp kiểm tra hiệu quả vắc xin và điều chỉnh quy trình tiêm phòng.
Đánh giá miễn dịch chéo với các genotype PCV2 đang lưu hành tại thực địa sau khi sử dụng vắc xin PCV2: Trường hợp này phòng thí nghiệm sử dụng chủng vi rút độc lực cao phân lập từ các ổ dịch để thực hiện phản ứng IPMA với huyết thanh lấy từ lợn được tiêm vắc xin.
Giám sát chương trình tiêm phòng PCV2: Giám sát kháng thể PCV2 trên lợn nái là một bước quan trọng trong quản lý sức khỏe sinh sản và đánh giá hiệu quả tiêm phòng vắc xin. Việc này giúp (1) Đảm bảo đàn nái được tiêm vắc xin đầy đủ và đúng lịch, (2) Quyết định thời điểm tiêm phòng nhắc lại. (2) Đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch (hiệu giá kháng thể PCV2) sau tiêm, (3) Phát hiện sớm nhóm nái có miễn dịch yếu hoặc nguy cơ bùng phát dịch.
Số lượng mẫu: chọn mẫu đại diện (10 - 20% đàn) hoặc tối thiểu 10 con/nhóm tuổi.
Thời điểm lấy mẫu
Phương pháp IPMA là công cụ hiệu quả trong chẩn đoán huyết thanh học, hỗ trợ đánh giá miễn dịch sau tiêm phòng và giám sát dịch bệnh PCV2 trên đàn lợn. Việc áp dụng kỹ thuật này tại phòng thí nghiệm Fivevet giúp nâng cao độ chính xác trong xét nghiệm và hỗ trợ điều chỉnh chương trình tiêm phòng phù hợp.
Câu hỏi thường gặp
1. IPMA là gì và tại sao nó được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng PCV2?
IPMA (Immunoperoxidase Monolayer Assay) là kỹ thuật miễn dịch nhuộm tế bào, giúp phát hiện kháng thể đặc hiệu chống lại vi rút trên mô hình tế bào nhiễm vi rút thực tế. IPMA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để đánh giá mức độ miễn dịch toàn diện sau tiêm vắc xin hoặc nhiễm tự nhiên PCV2.
2. IPMA có khác gì so với ELISA hay VNT không?
Có. So với ELISA, IPMA phát hiện kháng thể tổng thể trên tế bào nhiễm vi rút thật, trong khi ELISA thường chỉ phát hiện kháng thể trung hòa dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp. So với VNT, IPMA dễ thực hiện hơn, ít tốn kém nhưng vẫn phân biệt tốt genotype và có độ nhạy cao.
3. IPMA có thể phân biệt các type PCV2 như PCV2a, PCV2b, PCV2d không?
Có. IPMA sử dụng vi rút sống của từng genotype làm kháng nguyên nên có khả năng phân biệt kháng thể giữa các type PCV2. Điều này rất quan trọng để đánh giá hiệu quả vắc xin và miễn dịch chéo trong thực tế.
4. Thời gian trả kết quả của IPMA là bao lâu?
Quy trình IPMA mất khoảng 4 ngày, do cần nuôi cấy tế bào nhiễm vi rút trước khi nhuộm và đọc kết quả. Tuy thời gian lâu hơn ELISA, nhưng IPMA mang lại độ chính xác cao nhờ mô phỏng phản ứng miễn dịch thực tế.
5. IPMA được áp dụng ở đâu và có thể hỗ trợ công tác thú y như thế nào?
IPMA được áp dụng rộng rãi tại các phòng nghiên cứu và phòng xét nghiệm thú y như Fivevet, dùng để:
- Đánh giá hiệu quả vắc xin.
- Giám sát miễn dịch đàn lợn.
- Phát hiện sớm nguy cơ bùng phát dịch PCV2.
- Hỗ trợ xây dựng lịch tiêm phòng phù hợp.
Xem thêm:
-
Ứng dụng DNA tái tổ hợp trong vắc xin PCV2
-
Yếu tố ảnh hưởng đến miễn dịch sau tiêm PCV2
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
