KỸ THUẬT PHÂN LẬP VÀ KHÁNG SINH ĐỒ VI KHUẨN E. COLI TRÊN GIA CẦM

Escherichia coli là một loại vi khuẩn Gram âm, hình que, thuộc họ Enterobacteriaceae, sống trong đường ruột của người và động vật, đặc biệt là gia cầm. Cùng FiveLab tìm hiểu quy trình phân lập và kháng sinh đồ vi khuẩn E. coli trên gia cầm nhé.

Mặc dù phần lớn các chủng E. coli là vô hại và tham gia vào quá trình tiêu hóa, tuy nhiên một số chủng lại gây ra các bệnh lý nghiêm trọng như viêm phúc mạc, viêm phổi, viêm khớp, và nhiễm trùng máu, đặc biệt khi chúng xâm nhập vào các cơ quan ngoài ruột.
Tỷ lệ nhiễm E. coli trên gia cầm có thể dao động từ 5% - 30% tùy thuộc vào điều kiện chăm sóc và môi trường chăn nuôi. Chăn nuôi tập trung với mật độ nuôi nhốt cao, vệ sinh kém và sử dụng kháng sinh không kiểm soát là các yếu tố thuận lợi cho sự phát triển và lây lan của vi khuẩn này. Trong thực tế, để phòng ngừa và điều trị bệnh, phần lớn người chăn nuôi sử dụng nhiều loại kháng sinh khác nhau với liều lượng không đồng nhất và không rõ nguồn gốc. Điều này đã dẫn đến tình trạng vi khuẩn E. coli phát triển, kháng thuốc, gây khó khăn trong việc kiểm soát bệnh. Vì vậy, việc phân lập và kháng sinh đồ của vi khuẩn E. coli là một công cụ quan trọng giúp xác định phương pháp điều trị hiệu quả, giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn kháng thuốc và tối ưu hóa hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi. 

1. Lấy mẫu và bảo quản bệnh phẩm
- Phương pháp lấy mẫu và bảo quản được thực hiện theo QCVN 01-83:2011/BNNPTNT.
- Mẫu bệnh phẩm có thể bao gồm: mẫu phân được lấy từ hậu môn, mẫu máu, mẫu mô (gan, lách, phổi, tủy xương,…).
- Mẫu phải đặt trong hộp bảo quản có nhiệt độ từ 2ºC đến 8ºC trong quá trình vận chuyển. Phiếu gửi bệnh phẩm, danh sách mẫu kèm theo phải ghi rõ ràng, đầy đủ các thông tin cung cấp cho phòng xét nghiệm và phải đựng trong một túi nilon khác tách biệt với mẫu bệnh phẩm, tránh gây ướt làm thông tin không chính xác. Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy, gửi tới phòng xét nghiệm càng nhanh càng tốt.

2. Phương pháp phân lập vi khuẩn E. coli
2.1. Chuẩn bị dụng cụ và môi trường: 
Các loại môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E. coli như: thạch máu, thạch MacConkey,…
Hóa chất, nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm khác: Thuốc thử Kovac, các hóa chất và dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm nghiên cứu vi khuẩn.

2.2. Phân lập và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Ria cấy trực tiếp mẫu lên môi trường MacConkey Agar, ủ 37ºC trong 24 giờ. Trên thạch MacConkey, E. coli hình thành khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn bóng, rìa gọn, không nhày, đường kính 1-2 mm. Chọn 3-5 khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường MacConkey cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa Eosin Methylene Blue (EMB) và thạch máu, ủ 37ºC trong 24 giờ. Trên thạch EMB, khuẩn lạc có tâm màu đen, có ánh kim xanh. Trên thạch máu, khuẩn lạc màu trắng xám, tròn, bóng, có dung huyết hoặc không dung huyết.
 
Bắt khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường EMB và môi trường thạch máu để thực hiện phản ứng sinh hóa (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Cimmons Citrate – IMViC). 
Khuẩn lạc E. coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là ++ -- chính là E. coli.
 
3. Kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli với kháng sinh
Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn được kiểm tra dựa theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.

3.1. Thử kháng sinh
Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller hinton Agar (MHA) có độ dày thạch khoảng 4mm, đánh dấu đáy đĩa thạch để xác định các chủng thử. Sau đó, dùng que trang vô trùng láng đều huyền dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch. Để yên các đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi bề mặt thạch khô ráo. Dùng kẹp đã vô trùng gắp các đĩa tẩm kháng sinh đặt lên bề mặt thạch tại các vị trí đã được đánh dấu. Sau đó, các đĩa được đưa vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 16-18 giờ.

3.2. Đọc kết quả 
Sau 16-18 giờ, kết quả kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh được đọc bằng cách để đĩa thạch trên nền đen với ánh sáng phản chiếu. Đo đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh mỗi đĩa kháng sinh đã thử và so sánh với điểm nhạy cảm giới hạn của các loại kháng sinh được thử nghiệm theo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn lâm sàng, Phòng thí nghiệm (CLSI), Uỷ ban Châu Âu về kiểm tra độ nhạy cảm với thuốc (EUCAST).

 Các chủng E. coli sẽ được phân loại theo ba mức độ đáp ứng với kháng sinh: Nhạy cảm (S), Kháng (R), Trung gian (I).
Kết quả kháng sinh đồ giúp các bác sĩ thú y chọn lựa loại kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh.

Xem thêm:
- Vai trò quan trọng của kỹ thuật elisa trong chăn nuôi thú y.
- Định lượng kháng thể lở mồm long móng (FMD) trâu bò lợn bằng phương pháp LP Elisa.
- Phân biệt các kỹ thuật xét nghiệm PCR, RT PCR, qPCR và ứng dụng.