PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH NEWCASTLE

Nguyên tắc bảo quản vận chuyển mẫu bệnh phẩm

2. Phương pháp xét nghiệm:
2.1 Phát hiện virus Newcastle bằng phản ứng RT-PCR/Realtime RT-PCR
Quy trình được thực hiện qua 03 bước cơ bản: Tách chiết RNA => Tiến hành phản ứng => Đọc kết quả.
a/ Phản ứng RT-PCR
Sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR sẽ được đem đi điện di để phân tích kết quả. Điều kiện phản ứng được coi là hợp lệ khi mẫu đối chứng dương tính (đã biết trước kết quả) cho thấy vạch sản phẩm đúng như dự kiến, và mẫu đối chứng âm tính không xuất hiện vạch sản phẩm.
Các phản ứng RT-PCR hiển thị vạch sản phẩm như đối chứng dương là phản ứng Dương tính; Không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên là phản ứng âm tính.

Ảnh kết quả điện di mẫu bệnh phẩm xét nghiệm phát hiện virus Newcastle bằng phương pháp RT-PCR

ĐC+: Đối chứng dương tính virus Newcastle.
ĐC-: Đối chứng âm tính.
BF: Mẫu bệnh phẩm gà dương tính virus Newcastle.

b/ Phản ứng Realtime RT-PCR
Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) có giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính. Mẫu không có Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.
Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập vi rút) để khẳng định.

Kết quả mẫu bệnh phẩm xét nghiệm phát hiện virus Newcastle bằng phương pháp Realtime RT-PCR

Control +: Đối chứng dương tính virus Newcastle (Cq = 20,24).
Control +: Đối chứng âm tính (N/A).
BF: Mẫu bệnh phẩm gà dương tính virus Newcastle (Cq = 22,42).
2.2 Phát hiện virus Newcastle bằng phương pháp phân lập trên trứng
Chọn trứng gà có phôi từ 9 ngày tới 10 ngày tuổi, chọn trứng khỏe mạnh và không có chứa kháng thể Newcastle.
Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền vào xoang niệu mô của 03 trứng.
Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 °C và theo dõi trong vòng 72 h.
Thu hoạch dịch niệu mô từ 5 ml đến 10 ml/trứng vào các ống nghiệm riêng rẽ để giám định vi rút.

• *Xác định:

• *Đọc kết quả:

Tiêm trứng, phân lập virus

2.3 Phát hiện kháng thể Newcastle bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)
Sử dụng kháng nguyên Newcastle để tiến hành phản ứng HI:

• - Phản ứng âm tính: Xuất hiện các hạt ngưng kết lấm tấm, cho thấy không có kháng thể kết hợp với kháng nguyên trong phản ứng.
• - Phản ứng dương tính: Hồng cầu lắng xuống đáy, cho thấy có sự tương ứng giữa kháng nguyên và kháng thể. Hiệu giá kháng thể được xác định ở mức độ pha loãng cao nhất vẫn còn hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.

Huyết thanh được coi là dương tính kháng thể kháng vi rút Newcastle khi có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4 log₂).

                       Hình ảnh đĩa phản ứng HA-ND (Kết quả HA = 7HAU)
 

Hình ảnh đĩa phản ứng HI-Newcastle

3. Báo cáo kết quả:
 

Gia cầm được xác định mắc bệnh Newcastle khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh Newcastle.
Có kết quả xét nghiệm kháng nguyên vi rút Newcastle dương tính bằng một trong những phương pháp: Realtime RT-PCR, RT-PCR hoặc phân lập.
Hoặc Có kết quả dương tính kháng thể Newcastle bằng phương pháp HI (khi gia cầm chưa tiêm phòng vắc xin phòng bệnh Newcastle).

4. Các phương pháp Fivelab thực hiện:

• - Phương pháp xét nghiệm bệnh cúm gia cầm.
• - Giải pháp với bệnh Newcastle trên gà
• - Phát triển vắc xin phòng bệnh Newcastle genotype VII