Mycoplasma là một chi vi khuẩn có kích thước rất nhỏ, không có thành tế bào và có khả năng âm thầm tồn tại trong hệ thống nuôi cấy tế bào. Nhiễm Mycoplasma có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, chuyển hóa và các đặc tính sinh học của tế bào, từ đó làm sai lệch kết quả nghiên cứu và ảnh hưởng đến quy trình sản xuất.
Trong bài viết này, Fivevet sẽ chia sẻ đặc điểm của Mycoplasma, cách vi khuẩn này xâm nhập vào hệ thống nuôi cấy tế bào, những ảnh hưởng đối với tế bào và các phương pháp phát hiện, kiểm soát Mycoplasma.
Mycoplasma – mối nguy tiềm ẩn trong nuôi cấy tế bàoI. Mycoplasma là gì?
Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes và là nhóm vi khuẩn có cấu trúc đặc biệt do không sở hữu thành tế bào peptidoglycan. Kích thước của chúng rất nhỏ, khoảng 0,15–0,3 μm, đồng thời không hình thành nha bào. Đây cũng là một trong những đặc điểm giúp phân biệt Mycoplasma với nhiều nhóm vi khuẩn thường gặp khác.
Cấu trúc tế bào của Mycoplasma gồm các thành phần thiết yếu phục vụ quá trình sống và nhân lên chủ yếu gồm màng sinh chất, ribosome và vật liệu di truyền DNA sợi đôi dạng vòng. Do không có thành tế bào cố định hình dạng, Mycoplasma có thể biểu hiện nhiều dạng hình thái khác nhau như hình cầu, hình xoắn, hình nhẫn hoặc hình thoi.
Cấu trúc tế bào Mycoplasma với màng sinh chất, ribosome và vật liệu di truyền DNAMột điểm khiến Mycoplasma trở thành mối nguy đáng lưu ý trong nuôi cấy tế bào là tình trạng nhiễm có thể khó nhận biết bằng quan sát thông thường. Tế bào nuôi cấy không nhất thiết chết ngay và môi trường cũng có thể không xuất hiện những biến đổi rõ ràng. Trong khi đó, Mycoplasma vẫn có khả năng tác động đến sự tăng trưởng, chuyển hóa và đặc tính sinh học của tế bào, làm giảm độ tin cậy của kết quả nghiên cứu và ảnh hưởng đến quy trình sản xuất.
Việc thiếu thành tế bào cũng liên quan trực tiếp đến khả năng đáp ứng với một số nhóm kháng sinh. Những kháng sinh có đích tác động là quá trình hình thành thành tế bào vi khuẩn sẽ không phát huy hiệu quả theo cơ chế đó đối với Mycoplasma.
Trong các quy trình sản xuất vắc xin và sản phẩm sinh học, việc chủ động phát hiện và kiểm soát Mycoplasma vì thế có ý nghĩa quan trọng đối với việc duy trì chất lượng và tính nhất quán của quá trình sản xuất.
II. Mycoplasma xâm nhập vào hệ thống nuôi cấy tế bào như thế nào?
Khả năng tồn tại của Mycoplasma không chỉ giới hạn trong môi trường có tế bào sống. Trong những điều kiện dinh dưỡng thích hợp, một số loài có thể phát triển trong môi trường nhân tạo chứa các thành phần như huyết thanh hoặc chiết xuất nấm men. Nhiệt độ khoảng 35–37°C và pH 7,0–7,8 là những điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của Mycoplasma.
Một đặc điểm đáng chú ý là Mycoplasma thường không làm môi trường nuôi cấy lỏng trở nên đục rõ rệt. Trên môi trường rắn, vi khuẩn có thể hình thành các khuẩn lạc nhỏ, với vùng trung tâm sẫm màu phát triển lẫn xuống thạch và phần rìa mỏng hơn. Chính những đặc điểm này có thể khiến tình trạng nhiễm khó được nhận biết chỉ bằng quan sát thông thường.
Khi xuất hiện trong hệ thống nuôi cấy tế bào, Mycoplasma có thể phát triển trên bề mặt tế tương tác với tế bào chủ theo nhiều cách, trong đó đáng chú ý là bám dính lên bề mặt” bằng “phát triển trên bề mặt tế bào, xâm nhập vào bên trong hoặc trong một số trường hợp có thể hợp nhất với tế bào chủ.
Bám dính vào tế bào chủ
Đối với nhiều loài thuộc lớp Mollicutes, bám dính vào màng tế bào chủ là một trong những bước đầu tiên của quá trình thiết lập sự hiện diện trên tế bào. Sự tiếp xúc này giúp vi khuẩn duy trì mối liên hệ chặt chẽ với tế bào và tạo điều kiện cho quá trình xâm chiếm tiếp theo.
Xâm nhập vào bên trong tế bào
Một số Mollicutes còn có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào chủ. Đây là một cơ chế giúp chúng hạn chế tiếp xúc với các tác động bất lợi từ môi trường ngoại bào.
Hai loài thường được nhắc đến với khả năng này là M. penetrans và M. fermentans. Sau khi xâm nhập, chúng có thể tồn tại và nhân lên trong tế bào chủ trước khi được giải phóng ra ngoài thông qua quá trình xuất bào.
Hợp nhất với tế bào chủ
Trong một số trường hợp ít gặp, Mycoplasma có thể xảy ra tương tác kiểu hợp nhất với màng tế bào chủ. Khi đó, một số thành phần của vi khuẩn có thể được đưa vào tế bào và ảnh hưởng đến hoạt động bình thường của tế bào.Ví dụ nuclease của Mycoplasma phá hủy đến DNA của tế bào chủ.
Mycoplasma cũng có khả năng duy trì sự tồn tại qua quá trình đông lạnh – rã đông và có thể tồn tại trong huyết thanh khoảng 2 giờ ở 56°C. Ngược lại, chúng nhạy cảm với môi trường axit hoặc kiềm. Do không có thành tế bào, Mycoplasma đều kháng penicillin, một kháng sinh hướng đến quá trình tổng hợp thành tế bào.
Những nguồn có thể đưa Mycoplasma vào hệ thống nuôi cấy
Tình trạng nhiễm không chỉ xuất hiện trong giai đoạn nuôi cấy mà có thể bắt nguồn từ nhiều khâu khác nhau, từ tiếp nhận dòng tế bào, chuẩn bị môi trường đến thao tác và duy trì hệ thống nuôi cấy.
Các nguồn có thể đưa Mycoplasma vào hệ thống nuôi cấy tế bào.Dòng tế bào hoặc mẫu sinh học ban đầu
Một trong những nguy cơ quan trọng là dòng tế bào đã mang Mycoplasma trước khi được đưa vào phòng thí nghiệm. Dòng tế bào tiếp nhận từ nguồn bên ngoài nhưng chưa được kiểm tra có thể trở thành nguồn phát tán sang các dòng nuôi cấy khác.
Nguy cơ này đặc biệt đáng lưu ý khi nhiều dòng tế bào được thao tác đồng thời. Nhiễm chéo giữa dòng nhiễm và dòng không nhiễm có thể xuất hiện chỉ sau một số lần cấy chuyền (passage).
Môi trường nuôi cấy, huyết thanh và chất bổ sung
Do có kích thước rất nhỏ và không có thành tế bào, Mycoplasma có thể vượt qua một số hệ thống lọc thường sử dụng để loại bỏ vi khuẩn thông thường. Vì vậy, các hóa chất có nguồn gốc động vật cũng cần được xem xét trong đánh giá nguy cơ nhiễm.
Huyết thanh thai bò (FBS) từng được ghi nhận có liên quan đến các Mollicutes ký sinh trên bò, trong đó Acholeplasma laidlawii và Mycoplasma arginini. Tuy nhiên, với các sản phẩm thương mại hiện nay, nguy cơ này đã được giảm đáng kể nhờ quy trình sản xuất và kiểm soát chất lượng chặt chẽ hơn.
Thiết bị, dụng cụ và khu vực thao tác
Bề mặt làm việc, dụng cụ và thiết bị có thể trở thành nguồn trung gian làm phát tán Mycoplasma nếu quy trình làm sạch, khử nhiễm hoặc thao tác vô trùng không được thực hiện phù hợp.
Đặc biệt, việc dùng dụng cụ không được xử lý đúng cách có thể góp phần làm lây nhiễm giữa các dòng tế bào, bao gồm nguy cơ phát tán qua các giọt hoặc khí dung hình thành trong quá trình thao tác.
Nhân viên phòng thí nghiệm
Con người cũng là một nguồn có thể đưa Mycoplasma vào hệ thống nuôi cấy. Một số loài được phát hiện trong các mẫu nhiễm có liên quan đến hệ vi sinh đường hô hấp của người.
Vì vậy, các yếu tố như kỹ thuật thao tác chưa đúng, vệ sinh tay không đầy đủ, trang phục bảo hộ không phù hợp hoặc thực hành vô trùng chưa nghiêm ngặt đều có thể làm tăng nguy cơ nhiễm Mycoplasma trong phòng nuôi cấy.
III. Mycoplasma ảnh hưởng đến nuôi cấy tế bào như thế nào?
Với đời sống tế bào, nhiễm Mycoplasma có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh, khả năng sống và một số đặc tính chức năng của tế bào. Một số nghiên cứu ghi nhận sự giảm tốc độ tăng trưởng hoặc gia tăng stress tế bào khi nhiễm Mycoplasma.
Nhiễm Mycoplasma có thể làm thay đổi hoạt động sống và chức năng tế bào.
Mycoplasma cạnh tranh với tế bào chủ về chất dinh dưỡng và làm thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào. Do Mycoplasma có bộ gen rất nhỏ, hầu hết các loài không có gen sinh tổng hợp acid amin, vitamin,... nên chúng lấy tiền chất từ vật chủ cho hoạt động trao đổi chất của chúng.
Tế bào chủ vì thế bị mất tính toàn vẹn, thay đổi chức năng và hoạt động sống, đi đến chu trình apotosis.
Khi giải phóng các chất để phân hủy các thành phần tế bào, Mycoplasma tiết ra các sản phẩm phụ gây độc tế bào, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sức sống của tế bào chủ.
Tương tác kéo dài với Mycoplasma làm tế bào có thể mất ổn định nhiễm sắc thể, gia tăng hoặc giảm biểu hiện của nhiều gen.
Tuy nhiên, ảnh hưởng này không phải lúc nào cũng biểu hiện bằng sự giảm tăng sinh rõ rệt.
Chẳng hạn, nghiên cứu trên tế bào biểu mô thận LLC-PK1 cho thấy nhiễm Mycoplasma không làm thay đổi đáng kể sự tăng sinh trong mô hình nuôi cấy 2D, nhưng lại làm thay đổi đáng kể quá trình hình thành cấu trúc nang trong mô hình 3D.
Kết quả này cho thấy một tế bào vẫn có thể phát triển tương đối bình thường nhưng các đặc tính sinh học và chức năng của nó đã bị thay đổi (Marques et al., 2015).
Nhiễm Mycoplasma trong tế bào có thể làm sai lệch kết quả thí nghiệm do ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt động của tế bào. Từ đó, kết quả thu được có thể khó tái lập trong các lần thí nghiệm khác.
Trong một số trường hợp, tình trạng nhiễm Mycoplasma còn khiến nghiên cứu phải thực hiện lại hoặc thậm chí loại bỏ kết quả nghiên cứu.
Trong quy trình sản xuất, lây nhiễm Mycoplasma có thể làm gián đoạn do phải kiểm tra và xử lý tình trạng nhiễm. Điều này làm tăng chi phí kiểm tra, kiểm soát và xử lý sự cố.
Bên cạnh đó, nhiễm Mycoplasma còn tạo ra rủi ro đối với chất lượng nguyên liệu và các sản phẩm sinh học, ảnh hưởng đến độ an toàn và độ tin cậy của sản phẩm.
IV. Phát hiện và kiểm soát Mycoplasma
Để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của nghiên cứu cũng như sản xuất, việc phát hiện và kiểm soát Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào là rất quan trọng.
Phương pháp được sử dụng để phát hiện Mycoplasma trong nuôi cấy
Một số phương pháp phát hiện Mycoplasma thường được sử dụng gồm:Nuôi cấy
- Đây là phương pháp truyền thống, dựa trên khả năng phát triển của Mycoplasma trong môi trường nuôi cấy thích hợp. Phương pháp có độ tin cậy cao nhưng cần thời gian tương đối dài để phát hiện kết quả.
PCR
- Phương pháp này phát hiện vật liệu di truyền (DNA) của Mycoplasma. PCR có ưu điểm là thời gian phát hiện nhanh, độ nhạy cao và có thể phát hiện ngay cả khi lượng vật liệu di truyền từ Mycoplasma còn thấp.
Nhuộm huỳnh quang DAPI hoặc Hoechst
- Cho phép quan sát DNA trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang. Khi tế bào bị nhiễm, có thể quan sát các tín hiệu huỳnh quang bất thường xung quanh tế bào.
- Tuy nhiên, phương pháp nhuộm huỳnh quang có độ đặc hiệu thấp hơn PCR vì thuốc nhuộm có thể phát hiện DNA nói chung.
Bên cạnh việc phát hiện, cần thực hiện các biện pháp kiểm soát như kiểm tra định kỳ tế bào nuôi cấy, duy trì điều kiện vô trùng và xử lý hoặc loại bỏ các mẫu bị nhiễm nhằm hạn chế sự lây lan nhiễm chéo của Mycoplasma.
Mycoplasma có thể âm thầm tồn tại trong hệ thống nuôi cấy tế bào và ảnh hưởng đến đặc tính sinh học của tế bào, kết quả nghiên cứu cũng như quy trình sản xuất. Vì vậy, việc phát hiện và kiểm soát Mycoplasma có vai trò quan trọng trong duy trì chất lượng và độ tin cậy của nghiên cứu, sản xuất vắc xin và các sản phẩm sinh học.
Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển Vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet).
Tài liệu tham khảo
1. Drexler HG, Uphoff CC. (2002). Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology, 39(2), 75–90.
2. Marques LM, et al. (2015). The effects of mycoplasma contamination upon the ability to form bioengineered 3D kidney cysts. Cellular and Molecular Bioengineering.
3. Yu T, et al. (2016). Metabolomics reveals mycoplasma contamination interferes with the metabolism of PANC-1 cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408, 4267–4273.
Câu hỏi thường gặp
1. Vì sao Mycoplasma là mối nguy trong nuôi cấy tế bào?
Nhiễm Mycoplasma không nhất thiết khiến tế bào chết ngay hoặc làm môi trường nuôi cấy thay đổi rõ rệt. Vi khuẩn có thể âm thầm ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng, chuyển hóa và các đặc tính sinh học của tế bào, từ đó làm sai lệch kết quả nghiên cứu và ảnh hưởng đến quy trình sản xuất.
2. Mycoplasma có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy như thế nào?
Mycoplasma có thể sản sinh và nhân lên trong môi trường có hoặc không có tế bào sống. Vi khuẩn phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 35–37℃ và pH 7–7,8; chúng không làm đục môi trường lỏng và có thể tạo thành các khuẩn lạc nhỏ trên môi trường rắn.
3. Mycoplasma ảnh hưởng như thế nào đến tế bào nuôi cấy?
Nhiễm Mycoplasma có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng sinh, khả năng sống và một số đặc tính chức năng của tế bào, đồng thời làm thay đổi hoạt động sống và chức năng tế bào.
4. Những phương pháp nào thường được sử dụng để phát hiện Mycoplasma?
Ba phương pháp được đề cập trong bài gồm nuôi cấy, PCR và nhuộm huỳnh quang DAPI hoặc Hoechst.
5. PCR có ưu điểm gì trong phát hiện Mycoplasma?
PCR phát hiện vật liệu di truyền (DNA) của Mycoplasma, có thời gian phát hiện nhanh, độ nhạy cao và có thể phát hiện ngay cả khi lượng vật liệu di truyền từ Mycoplasma còn thấp.
Xem thêm:
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
