PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) BẰNG PP ELISA

1. Giới thiệu chung về bệnh: 
Dịch tả lợn châu Phi (ASF - African Swine Fever) là một bệnh lây nhiễm do virus ASFV gây ra. Đây là một loại virus AND thuộc họ Asfarviridae, thuộc giống Asfivirus. Trong tự nhiên, thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ 4 đến 19 ngày.
Các chủng virus có độc lực cao gây ra xuất huyết bán cấp và cấp tính, đặc trưng bởi sốt cao, chán ăn, xuất huyết da và cơ quan nội tạng, thường gây tử vong trong vòng 4 đến 10 ngày, thậm chí đôi khi lợn chết trước khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng. Những chủng có độc lực thấp hơn thường gây triệu chứng nhẹ như sốt nhẹ, chán ăn và mệt mỏi, dễ nhầm lẫn với các bệnh khác ở lợn.
Bệnh này có khả năng lây lan nhanh chóng và ảnh hưởng đến tất cả các loài lợn, bao gồm cả lợn nuôi và lợn hoang dã, ở mọi lứa tuổi. Tỷ lệ tử vong có thể đạt tới 100%, gây ra tổn thất nghiêm trọng. 2. Ý nghĩa của việc kiểm tra kháng thể ASFV:
a) Với những trại chưa tiêm phòng vắc xin ASFV: 
Kháng thể kháng ASFV xuất hiện sớm sau 7 – 10 ngày nhiễm bệnh. Đối với chủng độc lực cao, lợn thường chết trước khi hình thành kháng thể kháng ASFV. Những nơi có chủng nhược độc và chủng độc lực yếu lưu hành thì xét nghiệm huyết thanh học là cần thiết để xác định lợn đã phục hồi và bị nhiễm bệnh không có triệu chứng.
Kết quả kháng thể Dương tính ở lợn chưa tiêm phòng vắc xin được xác định là Lợn đang bị mắc bệnh Dịch tả lợn Châu Phi => Vì vậy việc định kỳ kiểm tra kháng thể ASFV trên đàn lợn là rất cần thiết.
b) Với những trại đã tiêm phòng vắc xin ASFV: 
Việc kiểm tra kháng thể sau khi tiêm phòng vắc xin ASFV là cần thiết để đánh giá được đáp ứng miễn dịch sau khi sử dụng vắc xin có tốt hay không, kháng thể có đạt bảo hộ không, độ đồng đều kháng thể trong đàn,… Thông qua đó đánh giá được Chất lượng vắc xin sử dụng, kỹ thuật tiêm vắc xin,…
3.Phát hiện kháng thể ASFV bằng phương pháp ELISA: 
Hiện nay có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể ASFV bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
a) Nguyên lý chung của phương pháp ELISA
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay) là một kỹ thuật sinh hóa được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực miễn dịch học để xác định sự hiện diện của kháng nguyên hoặc kháng thể trong mẫu thử.
Nguyên tắc hoạt động của phương pháp ELISA dựa trên tính chất đặc hiệu của sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể. Quá trình thực hiện cơ bản bao gồm các bước sau:
- Kháng nguyên (antigen) hoặc kháng thể (antibody) đã được xác định trước sẽ được cố định trên một bề mặt rắn.
- Sau đó cho mẫu có chứa kháng thể - antibody (KT) hoặc kháng nguyên (KN) cần tìm vào giếng.
- Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme.
- Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ thuỷ phân làm biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang.
b) Các loại phản ứng ELISA * Elisa trực tiếp – Đơn giản và tiết kiệm thời gian Phương pháp ELISA trực tiếp là một trong những kỹ thuật đơn giản nhất trong các phương pháp ELISA. Trong quy trình này, kháng nguyên (Antigen - Ag) được gắn lên bề mặt của một tấm nhựa. Sau đó, một loại protein (thường là albumin huyết thanh bò - BSA) được thêm vào để khóa các vị trí liên kết còn lại. Trong khi đó, một enzyme sẽ kết hợp với kháng thể trong một phản ứng riêng biệt, tạo thành phức hợp enzyme-kháng thể. Phức hợp này sẽ liên kết với kháng nguyên đã cố định trên tấm nhựa. Sau khi loại bỏ phần enzyme-kháng thể dư thừa, các phức hợp enzyme-kháng thể còn lại sẽ liên kết với kháng nguyên. Khi thêm cơ chất enzyme vào, tín hiệu phát ra sẽ phản ánh lượng kháng nguyên có trong mẫu thử.
Ưu điểm của phương pháp ELISA trực tiếp:
So với các phương pháp ELISA khác, phương pháp trực tiếp có ưu điểm là tiết kiệm thời gian hơn do chỉ sử dụng một loại kháng thể, dẫn đến quy trình thực hiện ngắn hơn và ít bước hơn. Phương pháp này phù hợp để kiểm tra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên, đồng thời giúp hạn chế khả năng xảy ra phản ứng chéo giữa các kháng thể khác.
Nhược điểm của phương pháp ELISA trực tiếp
Các kháng thể chính phải được đánh dấu riêng, nên tốn nhiều thời gian và không linh hoạt khi thực hiện nhiều thí nghiệm.
Ngoài ra, kỹ thuật xét nghiệm này có độ nhạy thấp hơn do các tín hiệu được khuếch đại ít hơn, điều đó có nghĩa là độ nhạy thấp hơn.
* Elisa gián tiếp Phương pháp ELISA gián tiếp bao gồm hai bước ELISA liên quan đến hai quá trình gắn của kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp được đánh dấu. Kháng thể sơ cấp sẽ được ủ với kháng nguyên trước và sau đó mới ủ với kháng thể thứ cấp. Tuy nhiên, việc này có thể dẫn đến các tín hiệu không đặc hiệu bởi vì xảy ra các phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp.
Ưu điểm của phương pháp ELISA gián tiếp
- Độ nhạy cao: nhiều kháng thể có thể được gắn nhãn và liên kết với mỗi phân tử kháng nguyên, làm tăng độ nhạy của phương pháp.
- Tính linh hoạt: có thể dùng nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau với cùng một kháng thể thứ cấp được đánh dấu, giúp linh hoạt trong việc thiết kế thí nghiệm.
- Tiết kiệm chi phí: kháng thể thứ cấp được sử dụng ít hơn, giúp giảm chi phí.
Trong phương pháp ELISA gián tiếp, kháng thể từ mẫu thử sẽ được kẹp giữa kháng nguyên đã được gắn trên đĩa và kháng thể thứ cấp đã được đánh dấu bằng enzyme. Khi thêm cơ chất enzyme vào, phản ứng màu sẽ diễn ra. Cường độ của màu sắc tỷ lệ thuận với lượng kháng thể có trong mẫu thử, tức là mẫu chứa nhiều kháng thể sẽ cho màu sắc mạnh hơn. ELISA gián tiếp phù hợp để định lượng tổng kháng thể có chứa trong mẫu.
* ELISA Sandwich:
ELISA sandwich là một phương pháp ít được sử dụng phổ biến hơn trong các loại ELISA, nhưng lại rất hiệu quả trong việc phát hiện kháng nguyên trong mẫu. Nhiều bộ kit thương mại cho phương pháp ELISA được phát triển dựa trên kỹ thuật này.
ELISA sandwich định lượng kháng nguyên bằng cách cho chúng ở giữa hai lớp kháng thể: kháng thể bắt (capture) và kháng thể phát hiện (detection). Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich. Trong hệ thống ELISA sandwich, thì các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng vẫn có thể được sử dụng giống như là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện. Kháng thể đơn dòng có một epitope duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên. Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt. ​(Epitope- Quyết định kháng nguyên, hay còn gọi là vị trí trên kháng nguyên và là nơi gắn với kháng thể).
Quy trình ELISA sandwich có thể gặp khó khăn trong việc tối ưu hóa, do cần phải kiểm tra cẩn thận sự kết hợp của các kháng thể. Việc đảm bảo rằng các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện nhận diện được các epitope khác nhau trên cùng một protein đích là rất quan trọng, nhằm tránh cản trở sự gắn kết của các kháng thể này. Ưu điểm của phương pháp ELISA Sandwich:
- Không yêu cầu mẫu tinh sạch: Mẫu thử không cần phải được xử lý tinh sạch trước khi tiến hành phân tích.
- Độ đặc hiệu cao: Sử dụng hai kháng thể giúp tăng độ đặc hiệu, khi các kháng nguyên hoặc chất phân tích được nhận diện và phát hiện một cách chính xác.
- Thích hợp cho các mẫu phức tạp: Kỹ thuật này phù hợp với các mẫu có tính phức tạp cao, vì kháng nguyên không cần phải được tinh sạch trước khi định lượng.
- Linh hoạt và độ nhạy cao: Cả hai phương pháp phát hiện trực tiếp và gián tiếp đều có thể áp dụng, mang lại tính linh hoạt và tăng độ nhạy cho phương pháp. Độ nhạy cao hơn 2-5 lần so với phương pháp ELISA trực tiếp hoặc gián tiếp, nhưng thấp hơn ELISpot.
* Elisa Cạnh tranh: