Tiếp nối Phần 1 về cơ sở phân tử, cơ chế hình thành phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) và các yếu tố ảnh hưởng, trong Phần 2, Fivevet sẽ tiếp tục làm rõ mối liên hệ giữa cơ chế phân tử và biểu hiện HA trong thực nghiệm, nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi hiệu giá HA, mối liên hệ giữa phản ứng HA và HI, cũng như ý nghĩa của phương pháp này trong nghiên cứu virus.
VI. Từ cơ chế phân tử đến biểu hiện thực nghiệm
Mối quan hệ giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu giá HA có thể được tổng hợp qua sơ đồ:
Cấu trúc HA → RBS của HA nhận diện acid sialic (SA) → Đặc hiệu receptor (α2,/α2,6 và cấu trúc glycan) → Affinity + Avidity + Multivalency → Nhiều HA liên kết nhiều SA → Hình thành mạng lưới virus – hồng cầu → Cân bằng HA – receptor – NA → Mức độ và độ bền ngưng kết → Kiểu hình HA trong giếng → Hiệu giá HA
Các yếu tố môi trường và thực nghiệm tác động: pH, nhiệt độ, ion/lực ion, thành phần đệm, thời gian ủ và loại hồng cầu.
Như vậy, hiệu giá HA là một kiểu hình phân tử – môi trường, chứ không phải phép đo trực tiếp tuyệt đối lượng virus.
VII. Biểu hiện của HA trong giếng phản ứng
Trong phép HA trên đĩa vi chuẩn độ, virus thường được pha loãng theo cấp số nhân rồi trộn với một lượng hồng cầu chuẩn hóa.
Khi virus không gây ngưng kết: Các hồng cầu tự do lắng xuống đáy giếng dưới tác dụng của trọng lực và tạo thành một nút hồng cầu nhỏ, rõ.
Khi virus gây ngưng kết: Các hồng cầu được nối với nhau thông qua mạng lưới virus–receptor và không thể tập trung thành một nút nhỏ. Chúng tạo thành một lớp phân bố rộng hơn ở đáy giếng.
Biểu hiện ngưng kết và không ngưng kết hồng cầu trong phản ứng HAVIII. Vì sao hiệu giá HA thay đổi khi thay đổi điều kiện?
Giả sử cùng một chủng virus được kiểm tra trong hai điều kiện thực nghiệm khác nhau:
Trường hợp A: Điều kiện thuận lợi cho phản ứng ngưng kết
HA có cấu hình ổn định → Hồng cầu có mật độ receptor phù hợp → pH và nhiệt độ thích hợp → NA chưa loại bỏ đáng kể receptor
→ Nhiều cầu nối HA–SA được hình thành → Mạng lưới virus–hồng cầu ổn định → Phản ứng ngưng kết rõ ràng → Virus vẫn gây ngưng kết ở độ pha loãng cao → Hiệu giá HA cao hơn.
Trường hợp B: Điều kiện bất lợi cho phản ứng ngưng kết
Receptor trên hồng cầu không phù hợp với HA → HA bị biến đổi cấu hình → pH hoặc nhiệt độ làm giảm hoạt tính HA → NA cắt receptor nhanh
→ Số lượng và độ bền cầu nối HA–SA giảm → Mạng lưới virus–hồng cầu không đủ ổn định → Hồng cầu lắng thành nút ở đáy giếng → Hiệu giá HA thấp hoặc không ghi nhận phản ứng ngưng kết.
Điều này đặc biệt quan trọng khi so sánh kết quả xét nghiệm HA giữa các phòng thí nghiệm. Sự khác biệt về loại hồng cầu, nguồn hồng cầu, mật độ receptor và điều kiện thực nghiệm có thể dẫn đến chênh lệch đáng kể về hiệu giá HA, ngay cả khi sử dụng cùng một chủng virus.
IX. Mối liên hệ giữa HA và HI
Phản ứng HI (hemagglutination inhibition) dựa trực tiếp trên cơ chế phân tử của HA.
Nếu kháng thể đặc hiệu gắn vào các vùng thích hợp trên HA, đặc biệt gần vùng RBS, nó có thể cản trở tương tác giữa HA và acid sialic trên hồng cầu.
Khi đó:
Virus + hồng cầu → ngưng kết
nhưng:
Khi mẫu chứa kháng thể có khả năng ức chế ngưng kết với nồng độ đủ cao, sự liên kết giữa virus và hồng cầu có thể bị ngăn cản, dẫn đến hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu.
Theo WHO, HI chính là việc kháng thể đặc hiệu với HA ngăn cản sự tương tác giữa HA của virus và receptor trên hồng cầu.
Tuy nhiên, HI cũng phụ thuộc mạnh vào loại hồng cầu. Ví dụ, trong một số nghiên cứu về virus cúm gia cầm, hồng cầu ngựa giàu receptor α2,3Gal có thể làm tăng độ nhạy của phép HI so với hồng cầu gà tây.
Do đó, khi đọc một kết quả HI, không thể chỉ xem xét “kháng thể có hay không” mà phải xem xét cả virus, HA, loại hồng cầu và điều kiện xét nghiệm.
X. Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phản ứng HA
Một số yếu tố quan trọng cần kiểm soát gồm:
Loại hồng cầu: Đây là một trong những nguồn biến thiên quan trọng nhất. Các loài khác nhau biểu hiện các loại glycan khác nhau trên bề mặt.
Nồng độ hồng cầu: Nếu nồng độ tế bào không được chuẩn hóa, hình thái lắng và khả năng hình thành mạng có thể thay đổi, gây khó khăn khi đọc kết quả.
pH: pH không phù hợp có thể làm thay đổi trạng thái cấu hình của HA hoặc ảnh hưởng đến tương tác HA–SA.
Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ ổn định HA, hoạt tính NA và tốc độ lắng của hồng cầu.
Thời gian ủ: Quá trình hình thành mạng lưới và quá trình lắng của hồng cầu đều phụ thuộc thời gian. Nếu đọc quá sớm hoặc quá muộn, kiểu hình có thể không phản ánh cùng một trạng thái động học.
Hoạt tính neuraminidase: NA có thể làm giảm receptor trên hồng cầu và dẫn đến hiện tượng virus tách khỏi tế bào.
Đặc tính riêng của chủng virus: Các đột biến tại vùng RBS có thể làm thay đổi ái lực đối với receptor. Vì vậy, virus có khả năng nhân lên tốt chưa chắc cho HA mạnh trên một loại hồng cầu cụ thể.
XI. Ý nghĩa của HA trong nghiên cứu virus
HA có một ưu điểm lớn là đơn giản, nhanh và không nhất thiết đòi hỏi virus phải còn khả năng nhân lên. Một mẫu có thể cho phản ứng HA khi chứa protein HA có khả năng gắn receptor, ngay cả khi virus không còn khả năng nhiễm hoàn chỉnh.
Vì vậy, HA không thể được xem là phép đo trực tiếp của infectivity.
Ngoài ra, HA có thể được sử dụng để:
- Phát hiện hoạt tính ngưng kết của virus.
- Ước lượng hiệu giá virus trong các hệ thống thích hợp.
- Hỗ trợ lựa chọn điều kiện cho các xét nghiệm HI.
- Nghiên cứu đặc tính receptor của HA.
- Theo dõi những thay đổi chức năng của HA.
- Hỗ trợ nghiên cứu đặc tính kháng nguyên của virus.
Tuy nhiên, do kết quả phụ thuộc vào receptor của hồng cầu và nhiều yếu tố môi trường, HA cần được diễn giải cùng với các phương pháp khác khi cần xác định chính xác danh tính hoặc khả năng nhiễm của virus.
Phản ứng ngưng kết hồng cầu có thể được hiểu một cách hệ thống thông qua chuỗi liên kết cấu trúc phân tử → tương tác hóa sinh → tính chất môi trường → kiểu hình tế bào.
Ở cấp độ phân tử, hemagglutinin nhận diện các glycan chứa acid sialic trên bề mặt hồng cầu. Một tương tác đơn lẻ tương đối yếu nhưng nhiều tương tác đồng thời giữa các HA và các receptor tạo ra hiệu ứng đa hóa trị, hình thành mạng lưới virus - hồng cầu. Chính mạng lưới này ngăn hồng cầu lắng thành nút và tạo nên hiện tượng ngưng kết quan sát được.
Ở cấp độ môi trường, pH, nhiệt độ, thành phần ion, hệ đệm, thời gian và đặc tính bề mặt hồng cầu có thể làm thay đổi trạng thái cấu hình của HA, khả năng gắn receptor và độ bền của mạng lưới. Đồng thời, neuraminidase có thể loại bỏ acid sialic và đối kháng với chức năng gắn của HA. Vì vậy, biểu hiện HA là kết quả của sự cân bằng động giữa HA–receptor–NA trong một môi trường cụ thể.
Ở cấp độ thực nghiệm, điều này giải thích tại sao cùng một virus có thể cho các hiệu giá HA khác nhau khi thay đổi loại hồng cầu hoặc điều kiện xét nghiệm. Do đó, Hiệu giá HA phải được hiểu là một đại lượng phụ thuộc điều kiện, chứ không phải chỉ đơn thuần là thước đo số lượng virus.
Có thể tóm tắt toàn bộ cơ chế bằng một câu:
Biến đổi ở mức phân tử của HA quyết định khả năng nhận diện receptor, tính chất của môi trường quyết định HA và receptor tồn tại ở trạng thái nào, còn sự kết hợp của hai yếu tố này quyết định liệu các tương tác phân tử có đủ mạnh và đủ nhiều để chuyển thành mạng lưới ngưng kết hồng cầu có thể quan sát bằng mắt hay không.
Bài viết được biên soạn bởi Phòng Nghiên cứu phát triển Vắc xin - Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương 5 (Fivevet).
Tài liệu tham khảo
World Health Organization. (2011). Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza. WHO.
World Health Organization. (2013). Serological detection of antibodies to avian influenza A(H7N9) virus by modified horse red blood cells haemagglutination-inhibition assay in human sera. WHO Collaborating Center for Reference and Research on Influenza.
Hirst, G. K. (1942). Adsorption of influenza hemagglutinins and virus by red blood cells. Journal of Experimental Medicine.
Câu hỏi thường gặp
1. Hiệu giá HA được xác định như thế nào?
Hiệu giá HA được xác định dựa trên độ pha loãng cao nhất của mẫu vẫn cho phản ứng ngưng kết hồng cầu theo tiêu chí đọc kết quả của quy trình xét nghiệm. Hiệu giá thường được biểu thị bằng giá trị nghịch đảo của độ pha loãng này.
2. Vì sao cùng một virus có thể cho hiệu giá HA khác nhau?
Hiệu giá HA phụ thuộc không chỉ vào đặc tính của virus mà còn vào loại hồng cầu, mật độ receptor, pH, nhiệt độ, thành phần ion, thời gian ủ và điều kiện xét nghiệm. Những yếu tố này có thể làm thay đổi khả năng hình thành và duy trì mạng lưới virus–hồng cầu.
3. Hiệu giá HA có phải là phép đo trực tiếp lượng virus không?
Không. Hiệu giá HA phản ánh hoạt tính ngưng kết hồng cầu trong điều kiện xét nghiệm cụ thể, không phải phép đo trực tiếp tuyệt đối số lượng virus hoặc khả năng gây nhiễm (infectivity). Một mẫu có thể còn hoạt tính HA nhưng virus không còn khả năng gây nhiễm hoàn chỉnh.
Xem thêm:
Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA): Cơ chế và các yếu tố ảnh hưởng
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
