1. Real-time PCR (qPCR) là gì?
Real-time PCR (qPCR) là kỹ thuật khuếch đại và theo dõi sự hình thành sản phẩm PCR thông qua tín hiệu huỳnh quang được ghi nhận trong quá trình phản ứng. Đây là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến và phổ biến nhất hiện nay trong chẩn đoán dịch bệnh, đặc biệt trong lĩnh vực thú y.
Khác với PCR thông thường, sản phẩm khuếch đại của qPCR được theo dõi trực tiếp khi phản ứng đang diễn ra. Vì vậy, khi sử dụng hệ thống probe hoặc dye phù hợp, người thực hiện không cần tiến hành bước điện di sau PCR để xác định sự có mặt của sản phẩm khuếch đại.
Trong xét nghiệm chẩn đoán, qPCR thường được sử dụng để phát hiện DNA hoặc RNA của tác nhân gây bệnh. Đối với RNA, mẫu RNA trước tiên được phiên mã ngược thành cDNA, sau đó cDNA tiếp tục được khuếch đại bằng PCR. Kỹ thuật này được gọi là RT-qPCR. Ở bài viết này,
Fivevet sẽ giúp người đọc hiểu rõ các thông số quan trọng và cách đọc kết quả Real-time PCR chính xác.
2. Đường cong khuếch đại trong qPCR được đọc như thế nào?
Đường cong khuếch đại, hay amplification curve, thể hiện sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang theo số chu kỳ PCR. Đây là một trong những yếu tố quan trọng cần quan sát khi phân tích kết quả Real-time PCR.
Các giai đoạn của đường cong khuếch đại
Thông thường, đường cong khuếch đại có thể được chia thành ba giai đoạn:
- Giai đoạn nền: Tín hiệu huỳnh quang còn thấp và chủ yếu là tín hiệu nền.
- Giai đoạn lũy thừa: Sản phẩm khuếch đại bắt đầu tích lũy, làm tín hiệu huỳnh quang tăng lên rõ rệt.
- Giai đoạn bão hòa: Phản ứng tiến đến giới hạn, tốc độ hình thành sản phẩm giảm và tín hiệu có xu hướng ổn định.
Một đường cong dương tính phù hợp thường tăng rõ ràng, liên tục và vượt qua đường threshold. Khi đọc kết quả, không nên chỉ nhìn vào giá trị Ct mà phải đánh giá cả hình dạng đường cong, vị trí threshold và kết quả của các đối chứng.
3. Chỉ số Ct/Cq trong Real-time PCR có ý nghĩa gì?
Ct, viết tắt của Cycle threshold, là số chu kỳ tại đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua ngưỡng phát hiện đã được thiết lập. Trong một số hệ thống, chỉ số này được gọi là Cq.
Có thể hiểu giá trị Ct theo nguyên tắc cơ bản như sau:
- Ct thấp: Lượng acid nucleic đích ban đầu thường cao hơn.
- Ct cao: Lượng acid nucleic đích ban đầu thường thấp hơn.
- Không có Ct: Tín hiệu không vượt qua threshold trong phạm vi số chu kỳ được phân tích.
4. Baseline trong qPCR là gì?
Baseline là giai đoạn đầu của phản ứng qPCR, khi tín hiệu huỳnh quang chủ yếu là tín hiệu nền và chưa xuất hiện sự gia tăng đặc hiệu rõ ràng.
Trong phần mềm qPCR, baseline được sử dụng để xác định mức tín hiệu nền, qua đó giúp hệ thống phân tích chính xác sự gia tăng của tín hiệu huỳnh quang.
Baseline không nhất thiết phải được cố định ở cùng một khoảng chu kỳ cho tất cả xét nghiệm. Việc thiết lập baseline cần phù hợp với phương pháp, hóa chất, thiết bị và đặc điểm đường cong của từng lần chạy.
5. Threshold trong qPCR là gì và được thiết lập như thế nào?
Threshold là mức tín hiệu huỳnh quang được sử dụng để xác định thời điểm tín hiệu của mẫu vượt ra khỏi tín hiệu nền. Điểm giao giữa đường cong khuếch đại của mẫu và threshold được dùng để xác định giá trị Ct.
Khi phân tích kết quả, cần lưu ý:
- Đặt threshold trong vùng tăng tín hiệu phù hợp của các mẫu.
- Không đặt threshold quá thấp, nằm trong vùng nhiễu nền.
- Không đặt threshold quá cao, nằm trong vùng bão hòa.
- Áp dụng tiêu chí phân tích nhất quán giữa các lần chạy theo quy trình đã được xác nhận hoặc thẩm định.
Việc thay đổi threshold có thể làm thay đổi giá trị Ct. Trong một số trường hợp, sự thay đổi này còn có thể ảnh hưởng đến kết luận cuối cùng của mẫu.
6. Chứng kiểm soát nội bộ (Internal Control – IC) có vai trò gì?
IC, viết tắt của Internal Control, là chứng kiểm soát nội bộ được sử dụng để đánh giá quá trình xét nghiệm.
Tùy theo thiết kế của phương pháp, IC có thể giúp kiểm soát một hoặc nhiều yếu tố sau:
- Quá trình tách chiết acid nucleic.
- Chất lượng mẫu.
- Sự có mặt của chất ức chế PCR.
- Hoạt động của phản ứng khuếch đại.
Kết quả IC cần được đánh giá theo tiêu chí cụ thể của phương pháp xét nghiệm. IC không đạt có thể cho thấy quá trình xét nghiệm gặp vấn đề và kết quả mẫu cần được xem xét lại.
7. Đối chứng dương (Positive Control – PC) được đánh giá như thế nào?
PC là đối chứng chứa trình tự đích hoặc vật liệu kiểm soát có khả năng tạo tín hiệu dương tính.
Đối chứng dương phải cho kết quả phù hợp với khoảng Ct đã được thiết lập trong phương pháp. Nếu PC không xuất hiện tín hiệu hoặc có Ct nằm ngoài giới hạn chấp nhận, cần kiểm tra tính hợp lệ của lần chạy trước khi đưa ra kết luận đối với mẫu bệnh phẩm.
8. Đối chứng âm (Negative Control – NC/NTC) có ý nghĩa gì?
Đối chứng âm không chứa trình tự đích cần phát hiện. Trong điều kiện của phương pháp, NC hoặc NTC phải không xuất hiện tín hiệu đích đặc hiệu.
Nếu đối chứng âm xuất hiện tín hiệu đích, cần xem xét khả năng nhiễm chéo hoặc những vấn đề khác trong quá trình thực hiện xét nghiệm. Khi đó, không nên vội vàng kết luận kết quả của các mẫu bệnh phẩm.
9. Cách đọc mẫu dương tính
Một mẫu được kết luận dương tính khi đáp ứng các điều kiện sau:
- Có đường cong khuếch đại đặc hiệu.
- Tín hiệu vượt qua threshold.
- Giá trị Ct nằm trong khoảng chấp nhận của phương pháp.
- Các đối chứng của lần chạy đạt yêu cầu.
- IC đáp ứng tiêu chí của phương pháp hoặc được giải thích phù hợp với thiết kế xét nghiệm.
10. Làm thế nào để xác định mẫu âm tính?
Một mẫu có thể được kết luận âm tính khi:
- Không phát hiện tín hiệu của trình tự đích trong phạm vi phát hiện của phương pháp.
- IC đạt yêu cầu.
- PC và NC đều đạt yêu cầu.
- Lần chạy PCR được xác định là hợp lệ.
Kết quả âm tính có nghĩa là không phát hiện trình tự đích trong phạm vi phát hiện của phương pháp, không đồng nghĩa với việc có thể loại trừ tuyệt đối tác nhân trong mọi trường hợp.
11. Mẫu nghi ngờ trong xét nghiệm qPCR được đánh giá như thế nào?
Một số phương pháp quy định vùng kết quả cần được xem xét lại khi Ct nằm gần giới hạn phát hiện. Đây có thể được gọi là vùng nghi ngờ hoặc borderline.
Đối với mẫu có giá trị Ct rất cao, cần xem xét một số khả năng:
- Tải lượng tác nhân thấp.
- Mẫu chứa ít acid nucleic.
- Acid nucleic bị suy giảm trong quá trình bảo quản.
Kết quả thuộc vùng nghi ngờ cần được đánh giá theo quy trình của phương pháp xét nghiệm và kết hợp với các thông tin liên quan trước khi đưa ra kết luận.
Bảng kết quả Real-time PCR
Trong bảng trên, mẫu M2 có tín hiệu đích với Ct = 19.68 và được kết luận dương tính. Mẫu M1 không có tín hiệu đích nhưng IC vẫn đạt, do đó được kết luận âm tính. PC cho kết quả dương tính và NC âm tính, phù hợp với vai trò của hai đối chứng trong lần chạy.
FiveLab là Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm và kiểm nghiệm thú y trực thuộc Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung Ương 5 (Fivevet). Chúng tôi sở hữu trang thiết bị hiện đại, quy trình đạt chuẩn quốc tế cùng đội ngũ chuyên gia giàu kinh nghiệm, hỗ trợ trang trại, người chăn nuôi quy trình lấy mẫu nhanh chóng, chính xác. Vui lòng liên hệ hotline để được tư vấn và hướng dẫn lấy mẫu xét nghiệm: 0822 120 555.
Bài viết được biên soạn bởi FiveLab - Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm và kiểm nghiệm thú y trực thuộc Công ty cổ phần thuốc thú y Trung Ương 5 (Fivevet).
Câu hỏi thường gặp
1. Ct thấp có phải luôn đồng nghĩa với mẫu dương tính không?
Ct thấp thường cho thấy lượng acid nucleic đích ban đầu cao hơn. Tuy nhiên, kết luận vẫn phải dựa trên đường cong khuếch đại, threshold, các đối chứng và tiêu chí của phương pháp.
2. Không có giá trị Ct có thể kết luận mẫu âm tính ngay không?
Không. Mẫu chỉ có thể được kết luận âm tính khi IC đạt yêu cầu, PC và NC đạt yêu cầu, đồng thời lần chạy PCR hợp lệ.
3. Vì sao không nên đặt threshold quá thấp?
Threshold quá thấp có thể nằm trong vùng nhiễu nền, làm xuất hiện giá trị Ct không phù hợp và ảnh hưởng đến việc diễn giải kết quả.
4. IC không đạt có ý nghĩa gì?
IC không đạt có thể liên quan đến quá trình tách chiết, chất lượng mẫu, chất ức chế PCR hoặc hoạt động của phản ứng khuếch đại. Kết quả mẫu cần được xem xét theo thiết kế của phương pháp.
5. Mẫu có Ct rất cao nên được xử lý như thế nào?
Mẫu có Ct rất cao cần được đánh giá theo vùng giới hạn của phương pháp. Các khả năng cần xem xét gồm tải lượng tác nhân thấp, lượng acid nucleic ít hoặc acid nucleic bị suy giảm trong quá trình bảo quản.
Xem thêm:
-
Nguyên lý, kỹ thuật nhuộm gram và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả trong chẩn đoán vi sinh
-
Danh sách điểm tiếp nhận mẫu xét nghiệm thú y
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
