PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BỆNH CÚM GIA CẦM

Bệnh cúm gia cầm là bệnh do virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra trên các loài gia cầm, thủy cầm và chim hoang dã. Các nhà nghiên cứu đã dựa vào độc lực của virus cúm gia cầm để xếp loại: bệnh cúm gia cầm độc lực cao, tỉ lệ chết rất cao và cúm gia cầm độc lực thấp với triệu chứng bệnh không rõ rệt và tỷ lệ chết thấp.
Virus cúm A mang hệ gen ARN, có khả năng biến đổi rất nhanh, tạo ra những chủng loại và nhánh mới là nguyên nhân gây ra các ổ dịch cúm gia cầm. Hãy cùng Fivevet tìm hiểu về phương pháp xét nghiệm căn bệnh nguy hiểm này.
1. Quy trình lấy mẫu bệnh phẩm:
1.1. Lấy mẫu xét nghiệm kháng nguyên (virus) 
- Mẫu xét nghiệm kháng nguyên: cần lấy 3 – 5 gam bệnh phẩm (não, phổi, khí quản, lách, ruột,...) của gia cầm bị bệnh.
- Đối với gia cầm còn sống, dùng tăm bông để ngoáy dịch ổ nhớp (swab), họng hoặc lấy một chút phân tươi sau đó cho vào dung dịch PBS; pH 7,2 đến 7,4; có bổ sung dung dịch kháng sinh theo tỉ lệ 1:10. 
1.2. Lấy mẫu xét nghiệm kháng thể
-  Dùng xy lanh 5ml lấy 1ml máu từ gia cầm nghi mắc cúm.
-  Để máu đông và tách huyết thanh ở nhiệt độ 20-30°C trong 30 phút.
-  Chuyển huyết thanh vào ống 1,5ml để xét nghiệm.
-  Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 2-8°C và vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong 24 giờ.
2. Phương pháp xét nghiệm
2.1 Phát hiện virus cúm gia cầm bằng phản ứng RT-PCR/Realtime RT-PCR
Phản ứng RT-PCR/realtime RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen M, H5, N1, N6, N8, H9, N2, …
Quy trình được thực hiện qua 03 bước cơ bản: Tách chiết ARN => Tiến hành phản ứng => Đọc kết quả.
a/ Phản ứng RT-PCR
Sản phẩm thu được sau khi phản ứng RT-PCR, đem điện di để đọc kết quả.
Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (biết trước kết quả) hiển thị vạch sản phẩm đúng như đã xác định, mẫu đối chứng âm tính không hiển thị vạch sản phẩm.
Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5 hoặc N1 được đọc như sau:
- Phản ứng RT-PCR phát hiện: hiển thị vạch sản phẩm 201 bp (cặp mồi: M52F và M253R) => gen M dương tính.
- Phản ứng RT-PCR phát hiện: hiển thị vạch sản phẩm 363bp (cặp mồi: H5F 936 và H5R 1299) => gen H5 dương tính.
- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 150 bp (AI N1-F6 và AI N1-595).
Các phản ứng RT-PCR được gọi là âm tính khi không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên.
Một số hình ảnh kết quả dương tính RT-PCR:

b/ Phản ứng Realtime RT-PCR
Điều kiện để phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (chuẩn độ trước) thì có giá trị Ct ≤ 25 (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct.
Với điều kiện như trên, mẫu được coi là dương tính khi có giá trị Ct ≤ 35. Mẫu không có Ct là âm tính. Mẫu đọc coi là nghi ngờ khi có giá trị 35 < Ct ≤ 40.
Cần xét nghiệm lại bằng phương pháp khác (phân lập virus) để khẳng định với những mẫu nghi ngờ.
Hình ảnh kết quả dương tính Realtime RT-PCR:

2.2 Phát hiện virus cúm gia cầm bằng phương pháp phân lập trên trứng:
- Chọn trứng gà có phôi từ 9 ngày đến 10 ngày tuổi, khỏe mạnh không có chứa kháng thể cúm.
- Mỗi mẫu bệnh phẩm cần được tiêm truyền vào xoang niệu mô của 03 trứng.
- Đặt trứng trong tủ ấp trứng 37 °C và theo dõi trong vòng 72h.
- Dịch niệu mô được thu hoạch từ 5ml đến 10ml/trứng vào các ống nghiệm riêng biệt để giám định virus.
Xác định: Trước khi tiến hành giám định, cần thực hiện các bước sau để xác định sự có mặt của virus cúm gia cầm (Newcastle, Virus gây hội chứng giảm đẻ) trong dịch niệu mô:
a. Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA):

• - Mục đích: Phát hiện đặc tính gây ngưng kết hồng cầu của virus.
• - Kết quả:

b. Giám định virus:
Có hai phương pháp chính:

• Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu hemagglutination inhibition (HI):
  • - Sử dụng kháng huyết thanh chuẩn H5/H9.
  •  - Kết quả:
    • + HI dương tính: Dịch niệu mô có virus cúm gia cầm.
    • + HI âm tính: Kết luận dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm.
• Phương pháp Realtime RT-PCR hoặc RT-PCR:
  • - Phát hiện trực tiếp vật liệu di truyền của virus.
  • - Kết quả:
    • + Realtime RT-PCR hoặc RT-PCR dương tính: Dịch niệu mô có virus cúm gia cầm.
    • + Realtime RT-PCR hoặc RT-PCR âm tính: Dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm.

Lưu ý:

• - Nếu HA âm tính, cần thực hiện cả hai phương pháp giám định HI và Realtime RT-PCR hoặc RT-PCR để khẳng định sự có mặt của virus cúm gia cầm.
• - Kết quả giám định dương tính bằng bất kỳ phương pháp nào đều khẳng định dịch niệu mô có virus cúm gia cầm.

Đọc kết quả:
Kết quả giám định (bằng HI hoặc phản ứng realtime RT-PCR hoặc RT-PCR) dương tính, tức là dịch niệu mô có chứa virus cúm gia cầm.
Kết quả giám định âm tính, điều đó chứng tỏ dịch niệu mô không có virus cúm gia cầm.
Trong trường hợp giám định ra kết quả âm tính, dùng dịch niệu mô thu hoạch ở lần thứ nhất để tiêm truyền trứng lần thứ hai, sau đó theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần thứ nhất để tiếp tục giám định. Nếu kết quả giám định của lần thứ hai vẫn âm tính thì có thể kết luận mẫu âm tính với virus cúm gia cầm.
2.3 Phát hiện kháng thể cúm gia cầm bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (HI)
- Sử dụng kháng nguyên tương ứng (H5N1, H5N6, H5N8 hoặc H9N2,…) để thực hiện phản ứng HI.
- Phản ứng sẽ là âm tính khi thấy có hạt ngưng kết lấm tấm, chứng tỏ không có kháng thể kết hợp với kháng nguyên trong phản ứng.
- Phản ứng dương tính: sẽ thấy có hồng cầu lắng xuống đáy, điều đó chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng. Hiệu giá kháng thể sẽ được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hoàn toàn.
Huyết thanh được coi là dương tính kháng thể kháng virus cúm gia cầm khi có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4 log₂). 3. Báo cáo kết quả
- Gia cầm được xác định mắc bệnh cúm gia cầm (chẳng hạn H5N1) khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm
- Có kết quả kiểm tra xét nghiệm kháng nguyên virus cúm gia cầm H5N1 dương tính bằng một trong các phương pháp sau: Realtime RT-PCR, RT-PCR hoặc phân lập (trên trứng hoặc tế bào).
- Hoặc có kết quả dương tính kháng thể H5N1 bằng phương pháp HI (lúc gia cầm chưa được tiêm vắc xin phòng cúm gia cầm).