Nhuộm Gram là phương pháp phân lập căn bản và quan trọng bậc nhất trong vi sinh vật học lâm sàng và kiểm nghiệm. Phương pháp giúp phân loại vi khuẩn thành hai nhóm chính là Gram dương và Gram âm, dựa trên sự khác biệt về đặc tính sinh hóa và cấu trúc thành tế bào.
Tuy nhiên, trong thực hành phòng thí nghiệm, sai lệch kết quả như Gram giả hoặc Gram biến đổi thường xuyên xảy ra dưới tác động của nhiều yếu tố kỹ thuật và ngoại cảnh. Việc hiểu rõ nguyên lý, nhận diện nguyên nhân gây sai lệch và áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng phù hợp là điều kiện cần thiết để nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán vi sinh. Trong bài viết này,
Fivevet sẽ giới thiệu nguyên lý của kỹ thuật nhuộm Gram, các nguyên nhân gây sai lệch và áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng phù hợp, từ đó góp phần nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán vi sinh.
I. Nhuộm Gram là gì và có vai trò như thế nào trong chẩn đoán vi sinh?
Phương pháp nhuộm Gram được phát triển bởi nhà bác học người Đan Mạch Hans Christian Gram vào năm 1884. Cho đến nay, đây vẫn là xét nghiệm đầu tay, giúp xác định định hướng ban đầu cho quá trình định danh vi khuẩn và lựa chọn phác đồ kháng sinh điều trị.
Bản chất của phản ứng Gram dựa trên sự khác nhau trong cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn.
Vi khuẩn Gram dương có cấu trúc như thế nào?
Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày khoảng 20–80 nm, được tổ chức theo dạng lưới đa tầng. Cấu trúc này có khả năng giữ chặt phức hợp Crystal Violet – Iodine (CV-I), ngay cả khi tế bào chịu tác động của chất tẩy màu.
Vi khuẩn Gram âm có cấu trúc như thế nào?
Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn, chỉ khoảng 2–7 nm, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng giàu lipopolysaccharide (LPS).
Khi sử dụng chất tẩy màu như cồn hoặc acetone, lipid ở màng ngoài bị hòa tan, làm tăng độ thấm của màng và khiến phức hợp CV-I bị rửa trôi. Sau đó, tế bào sẽ bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung, thường là Safranin hoặc Fuchsin, và có màu hồng hoặc đỏ.
Mặc dù nguyên lý tương đối đơn giản, việc đánh giá đúng bản chất Gram đòi hỏi quy trình phải được chuẩn hóa nghiêm ngặt. Sự biến đổi sinh lý của tế bào hoặc sai sót trong thao tác có thể dẫn đến kết quả âm tính giả, dương tính giả hoặc Gram biến đổi.
Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âmII. Những yếu tố nào ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram?
2.1. Tuổi của sinh khối vi khuẩn (Thời gian nuôi cấy)
Tuổi của sinh khối vi khuẩn hay thời gian nuôi cấy là một trong những yếu tố sinh học quan trọng nhất ảnh hưởng đến độ bền của thành tế bào.
Cơ chế: Khi khuẩn lạc bước vào giai đoạn suy thoái, thường sau hơn 24 giờ, quá trình tự phân (Autolysis) do enzyme nội bào kích hoạt có thể làm đứt gãy các liên kết peptidoglycan. Thành tế bào Gram dương bị tổn thương sẽ không còn khả năng giữ phức hợp CV-I.
Hệ quả: Vi khuẩn Gram dương có thể bắt màu hồng hoặc đỏ, tạo ra hiện tượng Gram dương giả Gram âm.
2.2. Vì sao kỹ thuật tẩy màu quyết định độ chính xác?
Tẩy màu bằng Ethanol 95% hoặc hỗn hợp cồn–acetone là bước nhạy cảm nhất, quyết định độ chính xác của toàn bộ quy trình nhuộm Gram.
Nếu tẩy màu quá mức: Do thời gian tiếp xúc quá lâu hoặc nồng độ chất tẩy quá cao, lớp peptidoglycan của vi khuẩn Gram dương có thể bị phá hủy. Khi đó, vi khuẩn Gram dương bị nhuộm thành Gram âm.
Tẩy màu chưa đủ: Do thời gian quá ngắn hoặc vết bôi quá dày sẽ khiến chất tẩy không tiếp xúc đầy đủ với vi khuẩn Gram âm dẫn đến vẫn giữ nguyên màu tím của Crystal Violet và tạo kết quả Gram âm giả Gram dương.
2.3. Cố định mẫu bằng nhiệt có thể gây sai lệch như thế nào?
Cố định nhiệt có mục đích làm biến tính protein, giúp tế bào bám chặt vào lam kính và dễ bắt màu hơn.
Quá nhiệt: Hơ lam kính quá lâu trên ngọn lửa đèn cồn làm biến dạng hình thái tế bào, phá hủy hoàn toàn vách tế bào khiến vi khuẩn không giữ được thuốc nhuộm.
Thiếu nhiệt: Mẫu bôi chưa cố định hoàn toàn sẽ bị trôi trong quá trình rửa nước ở các bước tiếp theo.
2.4. Mật độ và độ dày vết bôi tác động ra sao?
Vết bôi quá dày tạo ra nhiều lớp vi khuẩn chồng chéo, làm dung dịch Lugol và chất tẩy màu không thể thấm đồng đều vào các lớp bên trong.
Kết quả có thể xuất hiện hiện tượng “hỗn hợp Gram” trên cùng một loại vi khuẩn. Vùng rìa mỏng bị tẩy quá mức và biểu hiện Gram âm, trong khi vùng trung tâm dày không được tẩy hết nên vẫn biểu hiện Gram dương.
2.5. Chất lượng hóa chất nhuộm ảnh hưởng thế nào?
Dung dịch Lugol: Là chất gắn màu, giúp hình thành phức hợp CV-I có kích thước lớn. Tuy nhiên, Iodine dễ bị oxy hóa và thăng hoa khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc không khí. Lugol suy giảm hiệu lực sẽ khiến vi khuẩn Gram dương không giữ được màu tím.
Dung dịch Crystal Violet: để lâu có thể kết tinh hoặc lắng cặn. Các hạt cặn màu bám trên lam kính có thể tạo hình ảnh giả, gây khó khăn cho quá trình đọc và nhận định tiêu bản.
2.6. Tác động của môi trường nuôi cấy và chất kháng sinh
Kháng sinh tác động lên thành tế bào: Bệnh phẩm lấy từ động vật đang điều trị bằng các kháng sinh ức chế tổng hợp peptidoglycan (như Penicillin, Cephalosporin, Vancomycin) sẽ làm thành tế bào Gram dương bị khiếm khuyết, dẫn đến hiện tượng nhuộm Gram biến đổi (Gram-variable).
Môi trường chứa chất ức chế: Môi trường nuôi cấy có nồng độ muối cao hoặc chứa chất diện hoạt có thể làm thay đổi tính thấm màng tế bào.
III. Các lỗi nhuộm Gram thường gặp được khắc phục như thế nào?
Bảng tổng hợp các lỗi thường gặp và biện pháp khắc phục
IV. Quy trình kiểm soát chất lượng nhuộm Gram cần thực hiện như thế nào?
Để đảm bảo độ tin cậy của kết quả xét nghiệm, phòng thí nghiệm vi sinh cần áp dụng quy trình kiểm soát chất lượng theo tiêu chuẩn.
4.1. Sử dụng chủng chuẩn QC
Phòng thí nghiệm nên định kỳ nhuộm song song các chủng vi khuẩn chuẩn ATCC để đánh giá chất lượng hóa chất và kỹ thuật thực hiện:
Chủng Gram dương chuẩn: Staphylococcus aureus ATCC 25923. Kết quả yêu cầu là cầu khuẩn bắt màu tím.
Chủng Gram âm chuẩn: Escherichia coli ATCC 25922. Kết quả yêu cầu là trực khuẩn bắt màu hồng.
Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn chuẩn QC
4.2. Thực hiện thử nghiệm bổ sung (KOH 3% Test)
Trong trường hợp kết quả nhuộm Gram không rõ ràng hoặc xuất hiện hiện tượng Gram biến đổi, có thể thực hiện nhanh thử nghiệm KOH 3%.
Vi khuẩn Gram âm sẽ bị phá hủy màng tế bào khi tiếp xúc với KOH 3%, làm giải phóng DNA và tạo thành sợi dây nhầy dính. Trong khi đó, vi khuẩn Gram dương không xuất hiện hiện tượng này. Thử nghiệm giúp hỗ trợ đánh giá kết quả nhưng cần được thực hiện đúng kỹ thuật.
V. Làm thế nào để nâng cao độ chính xác của kỹ thuật nhuộm Gram?
Nhuộm Gram là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp nhưng đòi hỏi người thực hiện phải nắm vững nguyên lý sinh hóa và thao tác chính xác. Kiểm soát tốt tuổi của chủng, độ dày vết phết, thời gian tẩy cồn, nhiệt độ cố định mẫu và chất lượng thuốc thử là điều kiện tiên quyết để hạn chế sai lệch.
Bên cạnh đó, việc sử dụng định kỳ các chủng vi khuẩn chuẩn và áp dụng thử nghiệm bổ sung khi kết quả không rõ ràng sẽ góp phần nâng cao chất lượng chẩn đoán trong vi sinh lâm sàng và kiểm nghiệm.
FiveLab là Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm và kiểm nghiệm thú y trực thuộc Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung Ương 5 (Fivevet). Chúng tôi sở hữu trang thiết bị hiện đại, quy trình đạt chuẩn quốc tế cùng đội ngũ chuyên gia giàu kinh nghiệm, hỗ trợ trang trại, người chăn nuôi quy trình lấy mẫu nhanh chóng, chính xác. Vui lòng liên hệ hotline để được tư vấn và hướng dẫn lấy mẫu xét nghiệm: 0822 120 555
Bài viết được biên soạn bởi FiveLab - Trung tâm chẩn đoán xét nghiệm và kiểm nghiệm thú y trực thuộc Công ty cổ phần thuốc thú y Trung Ương 5 (Fivevet).
Tài liệu tham khảo
1. Sandle, T. (2020). Assessing Gram-stain error rates within the pharmaceutical microbiology laboratory. European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences, 25(1).
2. Popescu, A., & Doyle, R. J. (1996). The Gram stain after more than a century. Biotechnic & Histochemistry, 71(3), 145–151.
3. Claus, D. (1992). A standardized Gram staining procedure. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 8(4), 451–452.
4. Horobin, R. W. (2018). Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques (8th ed.). Elsevier.
Câu hỏi thường gặp
1. Nhuộm Gram được sử dụng để làm gì?
Nhuộm Gram được sử dụng để phân loại vi khuẩn thành hai nhóm chính là Gram dương và Gram âm dựa trên cấu trúc thành tế bào. Kết quả này giúp định hướng ban đầu cho quá trình định danh vi khuẩn, lựa chọn môi trường nuôi cấy và xây dựng phác đồ kháng sinh phù hợp.
2. Vì sao vi khuẩn Gram dương có thể bắt màu hồng?
Vi khuẩn Gram dương có thể bắt màu hồng khi lớp peptidoglycan bị tổn thương và không còn khả năng giữ phức hợp Crystal Violet – Iodine. Nguyên nhân thường gặp gồm mẫu cấy quá già, tẩy màu quá lâu, cố định nhiệt quá mức hoặc dung dịch Lugol suy giảm chất lượng.
3. Vì sao vi khuẩn Gram âm vẫn giữ màu tím sau khi nhuộm?
Vi khuẩn Gram âm có thể giữ màu tím nếu thời gian tẩy màu quá ngắn, vết bôi quá dày hoặc các tế bào chồng lấp khiến chất tẩy không tiếp xúc đồng đều. Để hạn chế tình trạng này, cần phết mẫu thành lớp mỏng và tẩy màu đều tay đến khi không còn màu tím chảy ra.
4. Nên sử dụng sinh khối vi khuẩn bao nhiêu giờ tuổi để nhuộm Gram?
Sinh khối vi khuẩn tươi trong giai đoạn tăng trưởng, tối ưu từ 18–24 giờ sau khi cấy, nên được ưu tiên sử dụng. Mẫu nuôi cấy quá 24 giờ có thể bước vào giai đoạn suy thoái, làm tổn thương thành tế bào và dẫn đến kết quả Gram giả hoặc Gram biến đổi.
5. Khi kết quả nhuộm Gram không rõ ràng cần xử lý như thế nào?
Khi kết quả không rõ ràng, cần kiểm tra lại tuổi của mẫu cấy, độ dày vết bôi, kỹ thuật cố định nhiệt, thời gian tẩy màu và chất lượng thuốc nhuộm. Phòng thí nghiệm có thể nhuộm đối chứng bằng chủng chuẩn QC hoặc thực hiện thử nghiệm KOH 3% để hỗ trợ phân biệt vi khuẩn Gram âm và Gram dương.
Xem thêm
-
Leptospirosis là bệnh gì?
-
KHÁNG SINH ĐỒ THÚ Y LÀ GÌ?
024 3376 6868 
info@fivevet.vn 
Đăng nhập 
VN
ENG
